鸡新城疫病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗技术

本发明专利技术提供了一种鸡新城疫病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物技术领域。该融合蛋白将鸡新城疫病毒F基因和HN基因序列进行串联，表达的融合蛋白具有抗原性好，表达量高的优点。该融合蛋白可应用于制备疫苗、抗体和用于检测鸡新城疫病毒的试剂盒。包含该融合蛋白的疫苗具有较好的免疫原性，该疫苗14日即可测定HI抗体几何平均滴度(GMT)均不低于1:64，而常规的灭活苗免疫后21日HI抗体几何平均滴度(GMT)不低于1:64，缩短断了疫苗免疫的空窗期，降低了生产成本低。

【技术实现步骤摘要】
鸡新城疫病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种鸡新城疫病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗。
技术介绍
鸡新城疫(newcastledisease，ND)是鸡新城疫病毒导致的禽类急性、接触性传染病，鸡新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)，基因组为单股负链不分节的RNA。鸡新城疫病毒主要能导致鸡败血症，容易出现下痢、呼吸困难、神经紊乱、浆膜与粘膜出血。该病的致死率高，严重威胁禽类养殖，属烈性传染病。在鸡新城疫的防治方面，已经投入了大量的人力、物力与财力来研究鸡新城疫的防止措施。目前鸡新城疫疫苗主要采用的是灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程苗等，其中灭活疫苗和弱毒疫苗具有生产工艺复杂、免疫保护力弱和生产成本高的缺点，逐步被基因工程疫苗所替代。现在常用的鸡新城疫基因工程苗多采用杆状病毒表达HN蛋白或F蛋白制备疫苗，虽然该疫苗安全稳定，但表达产物的抗体滴度低，影响了其实际应用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种鸡新城疫病毒的融合蛋白，该融合蛋白将及鸡新城疫病毒的F蛋白和HN蛋白进行串联表达。本专利技术的第二目的在于提供一种上述融合蛋白的制备方法，该制备方可以表达上述融合蛋白。本专利技术的第三目的在于提供一种上述融合蛋白或上述制备方法制备得到的蛋白的应用，可应用于制备疫苗、抗体和病毒检测等多个方面。本专利技术的第四目的在于提供一种包含上述融合蛋白的疫苗，该疫苗免疫原性好，保护效力高。为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：一种鸡新城疫病毒的融合蛋白，包括F区段和HN区段；所述F区段主要由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述HN区段主要由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。优选地，F区段和HN区段的排列顺序为F-HN，通过Linker连接；优选地，所述Linker具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。优选地，所述融合蛋白具有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。本专利技术还提供了一种上述融合蛋白的制备方法，将所述融合蛋白的基因在宿主中表达；优选地，使用哺乳动物表达系统表达所述融合蛋白的基因；优选地，使用CHO细胞表达系统表达所述融合蛋白的基因。优选地，提供包含表达所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入CHO细胞中，然后对CHO细胞进行加压筛选，再将加压筛选出的CHO细胞驯化成悬浮培养的细胞株，使所述悬浮培养的细胞株表达所述融合蛋白。优选地，使用谷氨酰胺合成酶筛选扩增系统加压筛选表达所述融合蛋白的CHO细胞株；优选地，所述CHO细胞表达系统使用的表达载体包括pcDNA3、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13。优选地，采用逐渐驯化的方法传代至少6代获得悬浮培养的表达所述融合蛋白的CHO细胞株。本专利技术还提供了一种上述融合蛋白或上述制备方法制备得到的蛋白的应用，包括如下(a)-(d)中的至少一种：(a)制备鸡新城疫病毒疫苗；(b)制备鸡新城疫病毒抗体；(c)制备鸡新城疫病毒抗体的试剂盒；(d)制备鸡新城疫病毒诊断抗原。本专利技术还提供了一种包含上述融合蛋白的鸡新城疫疫苗。优选地，所述疫苗中所述融合蛋白的浓度为20-100μg/ml，优选30-80μg/ml，更优选50μg/ml；优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂或MF59佐剂，优选使用白油佐剂。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的鸡新城疫病毒的融合蛋白，将鸡新城疫病毒F基因和HN基因序列进行串联，本专利技术通过对F基因和HN基因进行分析，选取了抗原性好，易高表达的区域进行串联，得到的融合蛋白具有抗原性好，表达量高的优点。本专利技术提供的上述融合蛋白的制备方法，通过将上述融合蛋白的基因在宿主中表达即可。本专利技术提供的上述融合蛋白和上述制备方法制备得到的蛋白的应用范围十分广泛，可以用以制备疫苗和抗体。抗体和上述融合蛋白可以应用于制备多种检测试剂和试剂盒，以用于检测鸡新城疫病毒抗体，例如使用含有鸡新城疫病毒抗体的ELISA试剂盒以检测鸡新城疫病毒，或者使用含有该融合蛋白的胶体金免疫层析试纸检测待测血清样品中的鸡新城疫病毒抗体含量。本专利技术提供的包含上述融合蛋白的疫苗，具有较好的免疫原性，免疫动物后可以产生较高滴度的抗体滴度，使动物获得较好的保护效果。通过免疫鸡新城疫融合蛋白，家禽获得良好的保护。同时使生产工艺简便，节省人力物力。该疫苗14日即可测定HI抗体几何平均滴度(GMT)均不低于1:64，而常规的灭活苗免疫后21日HI抗体几何平均滴度(GMT)不低于1:64，缩短断了疫苗免疫的空窗期，降低了生产成本低。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例2提供的pcDNA3-F-HN质粒图谱；图2为本专利技术实施例2提供的PCR鉴定结果；图3为本专利技术实施例2提供的酶切定结果。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术提供了一种鸡新城疫病毒的融合蛋白，该融合蛋白包括F区段和HN区段；所述F区段主要由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述HN区段主要由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。融合蛋白F(Fusionglyeoprotein，F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(HaemagglutininNeuraminidaseprotein，HN)是外部糖蛋白，位于囊膜表面并且这两种蛋白分别形成了病毒的大纤突和小纤突，它们是宿主重要的保护性抗原。F蛋白的基因分子量为59042kDa，编码一个含553个氨基酸的多肽。F基因从转录起始信号到polyA尾约有1792个核苷酸，含有一个开放阅读框。F蛋白含有3个抗原决定簇，在病毒的抗原性及其结构和功能上起着重要作用，F蛋白有两个七肽重复单位，这种单位每隔7个氨基酸就会出现一个疏水性氨基酸。HN蛋白是NDV中一种较大的蛋白，具有血球凝集(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性。HN基因全厂约2031bp，约占基因组的13.5％，含一个开放阅读框，胞外区有比较保守的半胱氨酸残基和糖基化位点。本专利技术提供的融合蛋白，将鸡新城疫病毒F基因和HN基因序列进行串联，本专利技术通过对F基因和HN基因进行分析，选取了抗原性高，并且较易高表达的区域进行串联，得到的融合蛋白具有抗原性好，表达量高的优点。在一些可选地实施方式中，F区段和HN区段的排列顺序为F-HN，通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡新城疫病毒的融合蛋白，其特征在于，包括F区段和HN区段；所述F区段主要由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，所述HN区段主要由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。

【技术特征摘要】
1.一种鸡新城疫病毒的融合蛋白，其特征在于，包括F区段和HN区段；所述F区段主要由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述HN区段主要由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，F区段和HN区段的排列顺序为F-HN，通过Linker连接；优选地，所述Linker具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。4.一种权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，将所述融合蛋白的基因在宿主中表达；优选地，使用哺乳动物表达系统表达所述融合蛋白的基因；优选地，使用CHO细胞表达系统表达所述融合蛋白的基因。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，提供包含表达所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入CHO细胞中，然后对CHO细胞进行加压筛选，再将加压筛选出的CHO细胞驯化成悬浮培养的细胞株，使所述悬浮培养的细胞株表达所述融合蛋白。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，使用谷氨酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，任立松，李延涛，陈泽良，任郭子君，
申请(专利权)人：天康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆,65