一种胰岛素衍生物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种胰岛素衍生物的制备方法，属于生物医药技术领域。采用本发明专利技术的融合体，有效促进胰岛素原蛋白在机体内的活性最大化，本发明专利技术还提供一套优化的蛋白体外变性复性反应体系，以使无活性的转铁蛋白‑胰岛素融合蛋白转变为有活性的转铁蛋白‑胰岛素融合蛋白，为转铁蛋白‑胰岛素融合的高效、低成本工业化生产提供一种新的、更为简化的工艺流程。

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛素衍生物的制备方法
本专利技术涉及一种胰岛素衍生物的制备方法，属于生物医药

技术介绍
糖尿病是一类以血糖偏高为主要症状的代谢性疾病，主要分为I型和II型。I型糖尿病(Type1DiabetesMellitus,T1DM)，又名胰岛素依赖型糖尿病，由自身免疫紊乱导致的胰岛β-细胞缺失所引起,多发生在儿童和青少年。II型糖尿病则由于外周组织对胰岛素的不敏感性(胰岛素抗性)，而胰岛β-细胞又分泌不足而引起的一种胰岛素相对不足的一种状况。据世界卫生组织数据显示，全球目前共有糖尿病患者4亿2千万，另外还有1.6亿人处于糖尿病前期。糖尿病已成为严重危害人类健康的重大疾病之一。胰岛素是由人体胰岛β细胞产生的，用于调节机体碳水化合物和脂肪代谢平衡的重要激素。在未来的20年，全球所需要的胰岛素消费将从目前的120亿美元增加至540亿美元。人血清转铁蛋白(HumanTransferrin,hTF)是一种非血红素结合铁的β-球蛋白，人转铁蛋白具有N端和C端两个同源性极高的结构域，能够与Fe3+紧密结合，由肝脏合成并最终分泌到血浆内。由于转铁蛋白能够通过转铁蛋白受体介导的方式在血清中反复的循环，稳定性很高，而且机体内各组织普遍分布有丰富的转铁蛋白受体，有学者曾提出将转铁蛋白作为一种蛋白标签与胰岛素分子进行融合来生产新的胰岛素衍生物。这种以转铁蛋白融合为基础的胰岛素衍生物至少有以下几个优点：(1)在血液中半衰期长，稳定性高，所以降糖效果好；(2)转铁蛋白受体遍布机体各组织，故其生物活性无组织局限性；(3)转铁蛋白为一天然血清蛋白，不会引起免疫或其它不良反应；(4)作为一种重组蛋白，生产工艺较其它胰岛素衍生物更为简单；(5)胰岛素原转铁蛋白的融合体，能够直接利用转铁蛋白受体介导的方式进入肝脏，并转变为有活性的胰岛素，故不需要在体外进行C肽的切割。因此，转铁蛋白-胰岛素融合蛋白具有很大的临床应用潜力。转铁蛋白-胰岛素融合蛋白可以通过应用转基因技术，在培养的高等生物细胞中进行生产。然而，利用培养的高等生物细胞进行转铁蛋白-胰岛素融合蛋白生产，其产量相对较低，操作难度较大、成本较高。而大肠杆菌则具有生长快速，生长周期短；易在分子水平上进行改造和修饰；培养基便宜；蛋白产量高的优势。因此，在胰岛素及其衍生物生产工业上，大肠杆菌是目前应用最为广泛的表达系统。大肠杆菌表达系统虽然广泛应用于胰岛素生产工业上，但存在着严重的技术瓶颈问题。大肠杆菌缺少真核细胞具有的蛋白翻译后的修饰能力，因此表达出来的目标蛋白通常会以不可溶的、无活性的包涵体形式存在，然后对来自包涵体的不溶蛋白进行复杂的变性和复性操作，使目标蛋白变为有活性。采用这样的方式制备得到的胰岛素衍生物活性较低，并且稳定性有待进一步提升。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种胰岛素原-转铁蛋白融合体，所述胰岛素原-转铁蛋白融合体融合表达了核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的胰岛素蛋白和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的转铁蛋白；所述胰岛素蛋白和转铁蛋白之间通过核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的linker连接。本专利技术的第二个目的是提供一种所述胰岛素原-转铁蛋白融合体的编码基因。本专利技术的第三个目的是提供一种携带上述编码基因的表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pET系列或pQE系列。本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述胰岛素原-转铁蛋白融合体的重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌的宿主细胞为大肠杆菌。本专利技术的第五个目的是提供一种所述重组菌的构建方法，包括如下步骤：(1)基因合成胰岛素原-转铁蛋白融合体的编码基因；(2)将上述编码基因通过连接酶插入pET28a载体中；(3)将步骤(2)中插入编码基因的载体导入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到所述的重组菌。本专利技术的第六个目的是提供一种所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体的变性、复性方法，包括如下步骤：(1)将包涵体先用洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2各洗涤两次，每次洗涤0.5～1.5h；所述的洗涤缓冲液1为50mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX100pH8.5；所述的洗涤缓冲液2为2M尿素，50mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX100pH8.5；(2)将步骤(1)洗涤后的包涵体用变性液进行溶解；所述变性液为8M尿素，50mMTris,50mMNaCl,1mMEDTA，50mMDTT，pH9.5；(3)将步骤(2)溶解的包涵体依次在复性液1、复性液2、复性液3、复性液4和复性液5中进行梯度透析复性，每级透析10～14h；所述复性液1为6M尿素，50mMTrisHCl，50mMNaCl，1mMEDTA，1.0mMGSH，0.1mMGSSG，pH9.5；所述复性液2为4M尿素，50mMTrisHCl，50mMNaCl，1mMEDTA，1.0mMGSH，0.1mMGSSG，pH9；所述复性液3为2M尿素，50mMTrisHCl，50mMNaCl，1mMEDTA，1.0mMGSH，0.1mMGSSG，pH8.5；所述复性液4为1M尿素，50mMTrisHCl，50mMNaCl，1mMEDTA，1.0mMGSH，0.1mMGSSG，pH8.0；所述复性液5为0.01MPBSpH7.5。在本专利技术的一种实施方式中，所述透析是在4℃以下进行透析。本专利技术的第七个目的是提供所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体在制备降血糖药物或保健品中的应用。本专利技术的有益效果是：采用本专利技术的融合体，有效促进胰岛素原蛋白在机体内的活性最大化，本专利技术还提供一套优化的蛋白体外变性复性反应体系，以使无活性的转铁蛋白-胰岛素融合蛋白转变为有活性的转铁蛋白-胰岛素融合蛋白，为转铁蛋白-胰岛素融合的高效、低成本工业化生产提供一种新的、更为简化的工艺流程。附图说明图1为胰岛素原-转铁蛋白融合基因表达载体示意图；图2为IPTG诱导ProINS-Tf重组蛋白表达结果；A：10％SDS-PAGE分析ProINS-Tf的表达情况；B：Westernblot分析ProINS-Tf的表达情况(M：蛋白marker；lane1：pET28a/BL21的细胞裂解产物；lane2：未诱导的pET28a-ProINS-Tf/BL21的细胞裂解产物；lane3-6分别为1mMIPTG诱导2h、4h、6h和8h的pET28a-ProINS-Tf/BL21的细胞裂解产物)；图3为ProINS-Tf重组蛋白的可溶性分析；M：蛋白marker；lane1：未诱导pET28a-ProINS-Tf/BL21的细胞裂解产物；lane2：pET28a-ProINS-Tf/BL21诱导8h的细胞裂解产物；lane3：pET28a-ProINS-Tf/BL21裂解沉淀；lane4：pET28a-ProINS-Tf/BL21裂解上清；图4为IPTG诱导ProINS-NTf重组蛋白表达结果；A：10％SDS-PAGE分析ProINS-NTf的表达情况；B：Westernblot分析ProINS-NTf的表达情况(M：蛋白marker；lane1：pET28a/BL21的细胞裂解产物；lane2：未诱导的pET28a-ProINS-NTf/BL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胰岛素原‑转铁蛋白融合体，其特征在于，所述胰岛素原‑转铁蛋白融合体融合表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的胰岛素蛋白和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的转铁蛋白；所述胰岛素蛋白和转铁蛋白之间通过核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的linker连接。

【技术特征摘要】
1.一种胰岛素原-转铁蛋白融合体，其特征在于，所述胰岛素原-转铁蛋白融合体融合表达了核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的胰岛素蛋白和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的转铁蛋白；所述胰岛素蛋白和转铁蛋白之间通过核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的linker连接。2.一种权利要求1所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体的编码基因。3.一种携带权利要求2所述的编码基因的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列或pQE系列。5.一种表达权利要求1所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体的重组菌。6.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主细胞为大肠杆菌。7.一种权利要求6所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)基因合成胰岛素原-转铁蛋白融合体的编码基因；(2)将上述编码基因通过连接酶插入pET28a载体中；(3)将步骤(2)中插入编码基因的载体导入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到所述的重组菌。8.一种权利要求1所述的胰岛素原-转铁蛋白融合体的变性、复性方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将包涵体先用洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2各洗涤两次，每次洗涤0.5～1.5h；所述的洗涤缓冲液1为50mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX100...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙乔明，宫燚，
申请(专利权)人：苏州康宇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32