基于发酵液复合盐析的吡咯喹啉醌二钠盐分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种基于发酵原料液的吡咯喹啉醌二钠盐的分离纯化方法，包括如下步骤：(1)一次过滤；(2)二次过滤；(3)吡咯喹啉醌的提取；(4)一次盐析；(5)活性炭脱色；(6)二次盐析；(7)结晶。本发明专利技术所述的分离纯化方法工艺操作简单，成本低廉，能有效缩短产品纯化周期，而且产品回收率高，产品纯度可高达到99.5％。

【技术实现步骤摘要】
基于发酵液复合盐析的吡咯喹啉醌二钠盐分离纯化方法
本专利技术属于生物化工及分离提纯
，具体涉及一种从发酵液中获得吡咯喹啉醌二钠盐的分离纯化方法。
技术介绍
吡咯喹啉醌(PQQ)的化学名是4,5-二氢-4,5-二氧化-1-氢吡咯(2,3f)醌-2,7,9-三羧酸，结构式如下：常温下为晶体，但其光谱学特性比较特殊，PQQ在紫外249nm波长下的吸收系数是18400mol-1·cm-1。主要作为电子受体或供体参与酶催化的氧化还原过程，其化学结构中的邻位醌3个羧基是其重要的功能基团。PQQ是参与氧化还原反应的辅因子，作为许多酶的辅酶，如脱氢酶、氧化酶、水合酶和脱羧酶。PQQ含有能直接参与氧化还原反应的邻醌类结构，以上酶蛋白可以催化非磷酸化的底物发生氧化反应，如醇类、醛类和醛糖类。此外，PQQ还被认为是继吡啶和核黄素之后的第三类参与氧化还原反应的辅因子。20世纪60年代，人们发现了一类新的能氧化多种一级醇，并以甲基吩嗪硫酸甲酯为最初受氢体的脱氢酶，它们不依赖于已知脱氢酶辅酶或辅基。直到1979年Durine才分离得到这个辅酶，随后Salisbury通过X射线衍射技术阐明了这种辅酶的结构并命名为吡咯喹啉醌。PQQ广泛存在于原核细胞与真核组织中，例如肺炎克雷伯氏菌、扭脱甲基杆菌、绿脓杆菌、变色多孔菌和漆树等。有趣的是，一些肠道微生物，例如大肠杆菌，不能合成PQQ，却能生产以PQQ为辅因子的辅蛋白。这种辅酶与假扭脱甲基杆菌、变色多孔菌、绿脓杆菌、不动杆菌属葡萄糖脱氢酶辅酶相同。PQQ作为一种具有多种生理功能的生物活性物质，在炎症、溶血性贫血、传输神经兴奋失调、肝病和骨质疏松症等疾病的治疗方面具有很大的潜力，同时在食品、农业方面亦具有广泛的应用前景，值得高度关注。目前，PQQ的生产成本仍高居不下，其中一个主要原因在于PQQ分离提纯技术还有待发展。PQQ可以通过化学合成法或生物合成法制备得到，其中化学合成法一般以酪氨酸分子作为碳和氮的骨架，通过一个dopaquinone的中间体，经一系列反应得到吡咯并喹啉醌，由于工艺复杂，异构体难以分离、生产成本高等诸多弊端而不常采用。目前，PQQ主要采用生物合成法制备获得，主要是利用某些细菌自身能合成PQQ的功能，通过发酵提纯的方法获得。PQQ广泛存在于革兰阴性菌中，但合成量却有所不同，有些菌只产生痕量PQQ供正常的生理代谢需求，如恶臭假单胞菌；还有些菌却能产生过量的PQQ，并分泌到胞外。迄今发现的能产生过量PQQ的野生菌包括无色杆菌属(Achromobacter)、交替单胞菌属(Alteromonas)、弯杆菌属(Ancylobacter)、生丝微菌属(Hy-phomicrobium)、甲烷单胞菌属(Methanomonas)、甲基菌属(Methy-lobacillus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、嗜甲基菌属(Methy-lophilus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微环菌属(Microcy-clus)、枝动菌属(Mycoplana)、假单胞菌属(Pseudomonas)、精朊杆菌属(Protaminobacter)、原单胞菌属(Protomonas)、硫杆菌属(Thiobacillus)及黄色杆菌属(Xanthobacter)等。采用微生物发酵的方法生产PQQ，使用的原始菌种PQQ产量在0.07-7mg/L，发酵时间为2-5天左右。因此，与化学合成法相比，人们认为生物学合成方法更具产业化意义。根据报道，目前未经优化或基因改造菌株的PQQ较高产量为448-695mg/L，在发酵产物浓度较低的情况下，如何高效的提取分离发酵产物也是提高PQQ产量的方法。但是目前现有技术中并没有工艺操作简单、成本低廉，产品回收率和纯度均高的从微生物发酵液中获取PQQ的方法。目前常规的PQQ提取分离方法为：PQQ发酵液→亲水性离子交换剂吸附→低盐溶液洗涤→高盐溶液洗脱→调pH≈2→反相吸附柱(0.75cm3)→70％甲醇洗脱→真空干燥。但该方法仅适合于少量发酵液制备PQQ，且仍处在实验室小规模试制阶段，制备的PQQ产品价格极其昂贵，高昂的成本极大的限制了PQQ的开发应用。专利文献CN1334084A公开了一种吡咯并喹啉醌的纯化方法，具体操作为，将发酵液上清经煮沸，离心过滤后吸附于FPLC-Q柱上，并经盐梯度洗脱，收集活性峰就能获得的吡咯喹啉醌，经检测此方法获得的PQQ纯度在90％以上，得率为56％。此纯化方法的缺陷在于，离心过滤虽然简便快捷，但很有可能破坏发酵液中的发酵菌，而且需要收集活性峰，不同的实验人员有不同的操作，使得产物的杂质含量不稳定，有时差异很大。因此，此工艺不符合工业批量生产的要求。专利文献CN105294687A公开了一种离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，该方法包括：制备含有吡咯喹啉醌的混合液，采用离子对双水相萃取体系对含有吡咯喹啉醌的混合液进行萃取，分离上层，得到富含吡咯喹啉醌的有机层，将富含吡咯喹啉醌的有机层上阴离子交换树脂，依次用双蒸水、稀酸冲洗，收集稀酸部位，冷冻干燥，纯化，得到吡咯喹啉醌。此专利技术采用四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，与PQQ结合在一起，使PQQ选择性的分配在有机相中，而其他水溶性杂质分配到水相中，从而达到分离纯化PQQ的目的。通常情况下，发酵液中除了含有要提取的发酵产物外还含有培养基，微生物以及微生物产生的一些次级代谢产物，仅用有机相和水相就能将PQQ与其他物质分离显然是不可行的。因此，此方法仅适合于含有吡咯喹啉醌成分且成分相对简单的混合液，而不适用于含有吡咯喹啉醌的成分复杂的发酵液。专利文献CN106188042A公开了一种采用分子印迹固相萃取法分离纯化发酵液中吡咯喹啉醌的方法，该方法主要利用吡咯喹啉醌分子印迹聚合物从富含吡咯喹啉醌发酵液中分离纯化得到吡咯喹啉醌。此专利技术以二氧化硅为基材，吡咯喹啉醌为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用热聚合技术制备得到吡咯喹啉醌分子印迹聚合物。吡咯喹啉醌分子印迹聚合物具有较好的特异、选择吸附目标物吡咯喹啉醌的性能，但是以该聚合物为固相萃取填料对目标产物吡咯喹啉醌进行固相萃取的效率取决于制备聚合物时加入的吡咯喹啉醌的量，投入成本较高，而且后续洗脱非常困难，会耗费大量的人力物力。总体而言，此专利技术所采用的印迹聚合物不适用于大批量的工业生产。专利文献CN104892597A公开了一种络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌，它的步骤如下：(1)将菌种发酵，得到发酵液；(2)发酵液经高速离心，将上清液在双溶质萃取体系进行络合萃取，其中三辛胺为络合剂，正己烷为稀释剂，得到富含吡咯喹啉醌的上层液；(3)将富含吡咯喹啉醌的上层液用氨水反萃，氨水层减压浓缩后，冷冻干燥，得到吡咯喹啉醌粗品；(4)将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解，用HCl将pH调至3～4后，加入乙醇，在20～25℃下搅拌5～6h，然后静置12-24h，得到吡咯喹啉醌。此专利技术先用三辛胺使其与吡咯喹啉醌络合，再解络合，虽然原理看似正确，但是在吡咯喹啉醌进行上述化学反应时对其本身的稳定性也造成了一定的威胁，而且在络合和反萃的过程中，向体系中又引入了新物质，对提取高纯度的吡咯喹啉醌产生阻碍。专利文献CN1329本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于发酵原料液的吡咯喹啉醌二钠盐分离纯化方法，其特征在于，主要包括如下步骤：(1)吡咯喹啉醌发酵液第一次过滤，得到吡咯喹啉醌一次滤液；(2)二次过滤，过滤得到除杂滤液；(3)在磁性高分子微球存在下，提取分离吡咯喹啉醌溶液；(4)一次盐析，获得吡咯喹啉醌二钠盐粗品；(5)活性炭脱色，得到脱色滤液；(6)二次盐析，获得吡咯喹啉醌三钠盐；(7)调酸，结晶，得到吡咯喹啉醌二钠盐；以及，任选地包括将所得吡咯喹啉醌二钠盐重结晶的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种基于发酵原料液的吡咯喹啉醌二钠盐分离纯化方法，其特征在于，主要包括如下步骤：(1)吡咯喹啉醌发酵液第一次过滤，得到吡咯喹啉醌一次滤液；(2)二次过滤，过滤得到除杂滤液；(3)在磁性高分子微球存在下，提取分离吡咯喹啉醌溶液；(4)一次盐析，获得吡咯喹啉醌二钠盐粗品；(5)活性炭脱色，得到脱色滤液；(6)二次盐析，获得吡咯喹啉醌三钠盐；(7)调酸，结晶，得到吡咯喹啉醌二钠盐；以及，任选地包括将所得吡咯喹啉醌二钠盐重结晶的步骤。2.如权利要求1所述的吡咯喹啉醌二钠盐分离纯化方法，其特征在于，包括如下具体步骤：(1)一次过滤：吡咯喹啉醌发酵液通过膜分离技术进行第一次过滤，得到吡咯喹啉醌一次滤液；(2)二次过滤：取上步得到的一次滤液，用酸调pH至4.0-4.3，除杂，搅拌1-1.5h后过滤，其中，滤膜预涂一层介孔二氧化硅，过滤得到除杂滤液；(3)吡咯喹啉醌的提取：向上步得到的除杂滤液中滴加浓硫酸，使pH至2.4-3.0，加入聚乙烯醇磁性微球进行吸附，吸附反应1-3h后吡咯喹啉醌接枝于磁性微球上，用磁场分离磁性微球；将磁性微球分散在水中，调pH至10-11发生水解反应，1-2h后用磁场分离磁性微球，得到吡咯喹啉醌溶液；(4)一次盐析：往吡咯喹啉醌溶液中加入无机钠盐或有机钠盐至盐浓度达到1.0-1.5mol/L，用硫酸调pH至2.8-3.8，使之成二钠盐形态析出，搅拌2-3h充分盐析后过滤，过滤结束用pH＝3.0-3.5的酸水洗涤滤饼；(5)活性炭脱色：将一...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茂华，蒋永飞，赖庆云，赵正国，陈亮，
申请(专利权)人：福建康鸿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35