一种丝素-短肽凝血微球的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种丝素‑短肽凝血微球的制备方法。由丝素和短肽复合而成，短肽为RGD、TI或者LD；将蚕茧脱胶后形成的纤维状丝素溶解获得丝素蛋白溶液；将丝素蛋白溶液与短肽混匀，注入无水乙醇自组装再超声冷冻，取出后使融化为乳白色溶液，经第一次离心后倒去上清液得到丝素蛋白颗粒，再经第二次离心后用去离子水洗涤两次，两次离心后超声第三次离心，弃去底部沉淀从而得到丝素蛋白微球悬浮液，超声后立刻冷冻；取出冷冻好的悬浮液，冷冻干燥所得丝素短肽微球粉末。本发明专利技术获得的产物具有优良的生物相容性，用途广泛，同时能配制溶液注射使用以及治疗体内脏器出血的凝血和外部创伤的凝血，环保无污染。

Preparation of silk fibroin-short peptide coagulation microspheres

The invention discloses a preparation method of silk fibroin short peptide coagulation microspheres. Compound of silk fibroin and short peptide, short peptide RGD, TI or LD; dissolve silk fibroin from degummed silkworm cocoon to obtain silk fibroin solution; mix silk fibroin solution with short peptide, inject anhydrous ethanol to self-assemble, then freeze by ultrasound, take out and melt into emulsion white solution. After the first centrifugation, pour the supernatant to obtain silk fibroin particles, and then centrifuge for the second time. The suspension of silk fibroin microspheres was obtained by washing with deionized water twice, then centrifuging with ultrasound for the third time, discarding the bottom precipitation, and then freezing immediately after ultrasound. The frozen suspension was taken out and the powder of silk fibroin microspheres was obtained by freeze-drying. The product of the invention has excellent biocompatibility and wide application, and can prepare solution for injection and coagulation for treating internal organ hemorrhage and external trauma. It is environmentally friendly and pollution-free.

【技术实现步骤摘要】
一种丝素-短肽凝血微球的制备方法
本专利技术涉及医疗临床治疗
，具体地说，是一种快速止血材料的制备方法。
技术介绍
出血是创伤后主要并发症，出血过多必将引起休克，危及生命。因此及时有效止血对挽救患者生命具有重要意义。有效的止血不但是内外科手术中急需解决的重要问题，也是战、创伤中提高伤员生存率的关键。出血后如何止血的问题一直困扰着人类。随着科学技术的不断发展，骨蜡等非可吸收性止血材料已大量应用于临床，但这些非可吸收性止血材料引起的术区感染和其他并发症在所难免，而各种新型医用敷料不断出现，性能也越来越优良，但这些新型敷料或多或少都存在着一些缺陷。近年来医用可吸收止血材料引起了各国医学界和产业界的高度重视，许多大型医药公司都致力于研发新型止血材料。发出新一代的快速止血和功能性止血材料势在必行，只要这样才能适应更高的手术要求，为人类健康提供良好保障。目前常用的止血材料有可吸收纤维蛋白胶、壳聚糖、可吸收性明胶海绵、α-氰基丙烯酸酯类组织胶、氧化纤维素和氧化再生纤维素。然而这些生物止血材料存在着自身的优势和劣势，有的止血效果欠佳，有的降解过程中会有毒副物产生且可能会发生排异反应，有的很难保存或是制作成本太高。更为重要的是，上述止血材料都是针对人体外部创伤出血所使用的材料，而对体内器官、组织出血没有效果。至今为止，尚无一种针对机体内外创伤出血、无毒性、无抗原性、不影响组织愈合、成本低廉的理想止血材料。因此，研究出一种综合性能高的止血材料，成为生物材料领域共同的热点和之一。丝素蛋白含有对人体极具营养价值的18种氨基酸，家蚕丝蛋白因其独特的力学性能和良好的生物相容性、抗菌性、无过敏性、降解性，以及本质是蛋白质的结构特点，经处理后可以得到再生丝素蛋白纤维、丝素蛋白粉末、丝素蛋白膜、丝素多孔材料等，在生物医学领域有着广泛的应用。然而至今为止，还没有一种丝素蛋白生物材料应用于快速凝血以及机体内部创伤凝血领域。
技术实现思路
针对传统止血材料的不足，本专利技术改进出了一种丝素微球凝血材料，是一种使用方便、保存简单、可以抑制体内出血的新型材料。本专利技术利用丝素独特的物理化学性质，与具有凝血功能的短肽复合，制备一种能模拟血小板高度形变的凝血微球的止血材料，给静脉出血的大鼠注射5mg/mL凝血微球溶液后发现小鼠伤口凝血时间明显缩短，给断尾小鼠的创口涂抹适量微球粉末后，出血时间减少，因此该材料可应用于止血领域，能够作为一种理想的注射型止血材料。本专利技术的具体技术方案如下：一、一种丝素-短肽凝血微球：所述微球是由丝素和短肽复合而成。所述的短肽为RGD、TI或者LD，短肽RGD、TI和LD的氨基酸序列分别为RGD、TRYLRIHPQSQVHQI、LPCDYYGTCLD。二、一种丝素-短肽凝血微球的制备方法：(1)将蚕茧脱胶后形成的纤维状丝素溶解在中性盐溶液中，经过过滤、透析、浓缩后获得0.2％－5％的丝素蛋白溶液；(2)将步骤(1)中的丝素蛋白溶液与短肽按重量分数比为200：1-9：1的比例混合均匀，用移液枪注入无水乙醇，使得乙醇终浓度为10％-50％，并混合均匀待其自组装一段时间，使用小功率超声仪超声1-10min；(3)将步骤(2)得到的溶液在-20摄氏度中冷冻24h；(4)将步骤(3)中的溶液取出后使融化为乳白色溶液，经第一次离心后倒去上清液得到丝素蛋白颗粒，再经第二次离心后用去离子水洗涤两次，两次离心后超声，接着再进行第三次离心，然后弃去底部沉淀从而得到单分散性较好的丝素蛋白微球悬浮液，用小功率超声仪超声3min；(5)将步骤(4)中得到的悬浮液立刻放入-20摄氏度冰箱，冷冻24h；(6)取出冷冻好的悬浮液，在冷冻干燥机中冷冻干燥24h，所得即为丝素短肽微球粉末。所述的步骤(2)中的短肽为RGD、TI或者LD，短肽RGD、TI和LD的氨基酸序列分别为RGD、TRYLRIHPQSQVHQI、LPCDYYGTCLD。所述的步骤(2)中的短肽为促进凝血而添加的凝血因子，来源于机体中凝血因子的蛋白核心序列。所述步骤(4)中，第一次离心以8000rpm的速度离心15min，第二次离心的离心速和第一次离心相同，第三次离心以500rpm的离心速度离心15min。所述的中性盐溶液为9mol/L的LiBr溶液、质量分数为50％的氯化钙溶液。所述方法制成的丝素-短肽凝血微球既能用于外部创伤，又能用于注射。制成的丝素短肽微球具有很好的促进血液凝固的功能，可直接将丝素-短肽凝血微球粉末外敷在创伤出血部位进行凝血；也能够将丝素-短肽凝血微球粉末溶于生理盐水，通过注射器注入体内，用于脏器出血部位的凝血。与现有技术相比，本专利技术具有以下突出特点：(1)优良的生物相容性；原料中使用的丝素蛋白和短肽都为天然活性物质，丝素蛋白普遍应用于生物医疗材料行业，不对皮肤产生刺激。短肽来自人体中天然存在的成分，不会对人体产生危害。(2)用途广泛，同时能配制溶液注射使用以及治疗体内脏器出血的凝血和外部创伤的凝血。(3)保存简单，冷冻干燥后的粉末保存在低温，干燥状态下即可。(4)针对现有止血材料存在的问题，提供了一种制作简单，适合于大规模生产的方法。附图说明图1为实施例2中所制备丝素短肽微球扫描图；图2为实施例3中所制备的丝素短肽微球粉末对小鼠断尾创伤部位的凝血效果图：(a)未添加丝素短肽微球粉末在1min40s时的照片，断尾处依然在出血，(b)添加丝素短肽微球粉末在1min40s时的照片，断尾处已经止血；图3为实施例4中所制备的丝素短肽微球对大鼠体内静脉血管创伤部位的凝血效果柱状图。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步的详细说明，以下实施例是对本专利技术的解释而本专利技术并不局限于以下实施例。本专利技术的实施例如下：实施例1(1)用9mol/L的LiBr溶液溶解脱胶后的蚕茧纤维，经过过滤、透析、浓缩后获得0.2％的丝素蛋白溶液；(2)将9mL步骤(1)中的丝素蛋白溶液与2mg短肽(TI)混合均匀，用移液枪快速注入无水乙醇1mL并混合均匀，待其自组装2min；(3)将(2)中得到的溶液用小功率超声仪超声3min；(4)将(3)得到的溶液，在－20摄氏度中冷冻24h；(5)取出后使其缓慢融化为乳白色溶液，以8000rpm的速度离心15min，倒去上清液即得到丝素蛋白颗粒，在同样的离心速度下用去离子水洗涤两次，两次离心后超声15min后以500rpm的离心速度离心15min，弃去底部沉淀从而得到单分散性较好的丝素蛋白微球悬浮液。(6)将(5)所得悬浮液用小功率超声仪超声3min；(7)将(6)中得到的悬浮液立刻放入－20摄氏度冰箱，冷冻24h；(8)取出冷冻好的悬浮液，在冷冻干燥机中冷冻干燥24h，所得即为丝素短肽微球粉末。(9)将实验小鼠进行断尾(尾部约4cm处截断)，再将所得丝素短肽微球粉末5mg贴敷在断尾处。丝素短肽微球粉末组在1min40s后即停止出血，而未添加丝素短肽微球粉末组在8min之后才流血停止。可见，本专利技术的凝血材料不但大大降低出血速率，而且出血总量也得到了显著的减少。实施例2(1)用9.3mol/L的LiBr溶液溶解脱胶后的蚕茧纤维，经过过滤、透析、浓缩后获得2％的丝素蛋白溶液；(2)将8mL丝素蛋白溶液与4mg短肽(RGD)混合均匀，用移液枪快速注入无本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丝素‑短肽凝血微球，其特征在于：所述微球是由丝素和短肽复合而成。

【技术特征摘要】
1.一种丝素-短肽凝血微球，其特征在于：所述微球是由丝素和短肽复合而成。2.一种丝素-短肽凝血微球的制备方法，其特征在于：所采用的具体制备步骤如下：(1)将蚕茧脱胶后形成的纤维状丝素溶解在中性盐溶液中，经过过滤、透析、浓缩后获得0.2％－5％的丝素蛋白溶液；(2)将步骤(1)中的丝素蛋白溶液与短肽按重量分数比为200：1-9：1的比例混合均匀，用移液枪注入无水乙醇，使得乙醇终浓度为10％-50％，并混合均匀待其自组装一段时间，使用超声仪超声1-10min；(3)将步骤(2)得到的溶液在-20摄氏度中冷冻24h；(4)将步骤(3)中的溶液取出后使融化为乳白色溶液，经第一次离心后倒去上清液得到丝素蛋白颗粒，再经第二次离心后用去离子水洗涤两次，两次离心后超声，接着再进行第三次离心，然后弃去底部沉淀从而得到单分散性较好的丝素蛋白微球悬浮液，用超声仪超声3min；(5)将步骤(4)中得到的悬浮液立刻放入-20摄氏度冰箱...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨明英，帅亚俊，钱昱，王珏，王鹏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33