具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种具有吡啶‑联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂及其制备方法，属于均相荧光免疫分析技术领域。该螯合剂的结构式如式1所示。所述的结构为吡啶‑二(2,2‑联吡啶)结构,在吡啶4位上引入单蛋白质连接基团，该结构有利于提高发光效率，减少标记物荧光淬灭；该螯合剂穴状结构具有热稳定性和动力学螯合稳定性。本发明专利技术还提供一种具有吡啶‑联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂的制备方法。本发明专利技术的螯合剂激发光谱波长范围为258‑356nm，最大激发波长为331nm；铕离子特征的荧光光谱峰593、616nm(

【技术实现步骤摘要】
具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂及其制备方法
本专利技术属于均相荧光免疫分析
，具体涉及一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂及其制备方法。
技术介绍
均相时间分辨免疫分析技术-ELISA的替代技术，无需洗涤、两步操作，具有无可比拟的优势,操作非常简单：空板直接加样，加完即可检测；体系非常稳定：7天之内可随时检测，信号基本不变；数据客观真实：可有效去除背景荧光，假阳性率、假阴性率低。均相时间分辨荧光免疫分析技术结合了荧光共振能量转移(FRET，FluorescenceResonanceEnergyTransfer)和时间分辨荧光(TRF，TimeResolvedFluorescence))两种技术。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素的螯合标记物和XL665作为一个供体(Donor)，是基于Eu穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物)之间的荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能量转移中，受体的发射的荧光寿命与供体的发射荧光的寿命相同。因为含Eu供体的荧光衰减时间较长，会诱导XL665受体长时间地发射荧光，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。均相时间分辨荧光免疫分析技术是基于TR-FRET技术，它使用了镧系离子标记化合物，具有长的荧光寿命，大的Stroke’sshift；同时，镧系离子穴状物(Cryptate)与其它螯合物结构(Chelate)相比，显著增加了稳定性。将一个稀土阳离子纳入到立体笼中的穴状结构,可收集光然后将能量转移到核心的镧系离子,大环的性质形成异常稳固的复合体。穴能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子(Mg2+和Mn2+等)、螯合物(EDTA)、溶剂或者温度。从均相时间分辨荧光免疫分析技术能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血清(50％)。在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性。穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需要的次数去读，进行动力学检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂及其制备方法，该螯合剂穴状结构具有热稳定性和动力学螯合稳定性，荧光寿命长。本专利技术首先提供一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，该螯合剂的结构式如式1所示：其中，R1选自OH、n选自1～10的整数；R2、R3彼此独立地选自H、取代或未取代的烷基、烷氧基、卤素、取代或未取代的氨基、硝基、取代或未取代的酰胺基、羧基、酯基、取代或未取代的吡咯烷二酮。优选的是，所述的R2、R3彼此独立地选自H、甲氧基、氨基、羧基或吡咯烷二酮。优选的是，所述的具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，该螯合剂的结构式如式Ⅰ至III所示：本专利技术还提供具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂的制备方法，该方法包括：步骤一：2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯的合成将溶剂、Li2CO3和N,N',N,N'-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二胺加入到反应瓶中回流1-3h，然后滴加2-(2,6-二溴甲基吡啶-4-氧基)乙酸乙酯溶液，继续回流30-60h，冷却至室温，过滤、减压浓缩后过硅胶柱层析纯化,得到2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯；步骤二：2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯-Eu3+的合成将步骤一得到的2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯溶液和EuCl3加入到反应瓶中，搅拌回流40-60h，冷却至室温，清洗过滤烘干得到2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯-Eu3+；步骤三：螯合剂的合成将步骤二得到的2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯-Eu3+在碱性条件下水解，或者加入胺类化合物反应，得到具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂。优选的是，所述步骤一中的溶剂为乙腈或四氢呋喃。优选的是，所述步骤一中N,N',N,N'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺与2-(2,6-二溴甲基吡啶-4-氧基)乙酸乙酯的摩尔比为1:(1～2)。优选的是，所述步骤二中的2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯与EuCl3摩尔比为1:(2～10)。优选的是，所述的步骤三的碱性水解时间为3～6h。优选的是，所述的步骤三的加入胺类化合物,反应温度为-20～0℃，反应时间为3～8h。本专利技术的有益效果本专利技术提供一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，该螯合剂的结构如式1所示，所述的吡啶-联吡啶结构有利于更紧密的将稀土离子包裹在穴状体内、水分子不易进入，该结构有利于减少反应体系对荧光的淬灭，从而提高检测系统的灵敏度；在吡啶4位上引入单蛋白质连接基团，有利于提高发光效率及螯合剂内部能量向Eu3+离子的转移；该螯合剂穴状结构具有热稳定性和动力学螯合稳定性；实验结果表明：本专利技术的螯合剂激发光谱波长范围为258-356nm，最大激发波长为331nm；铕离子特征的荧光光谱峰593、616nm(5D0-7F1,5D0-7F2能级跃迁)，斯托克斯位移约为285nm，荧光寿命大于500μs。本专利技术提供一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂的制备方法，该制备方法简单、原料易得，将得到的螯合剂进行活化，与甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体进行偶联，结果表明：甲胎蛋白单克隆抗体的标记回收率为90％，标记率为9.8，标记前后免疫活性无明显差异。该专利技术为时间分辨荧光免疫分析螯合剂提供了新品种，具有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例1制备得到的中间体A3的核磁共振氢谱图；图2为本专利技术实施例1制备得到的中间体A3的质谱图；图3为本专利技术实施例1制备得到的具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂A5的质谱图；图4为本专利技术实施例1制备得到的具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂的荧光激发光谱图和发射光谱图；图5为本专利技术实施例1制备得到的具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂的水溶液的荧光寿命图。图6为本专利技术实施例7稀土荧光标记物制备过程中标记抗体与未标记抗体免疫活性的比较图。具体实施方式本专利技术首先提供一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，该螯合剂的结构式如式1所示：其中，R1选自OH、NH2、n选自1～10的整数，优选为2～5的整数；R2、R3彼此独立地选自H、取代或未取代的烷基、烷氧基、卤素、取代或未取代的氨基、硝基、取代或未取代的酰胺基、羧基、酯基、取代或未取代的吡咯烷二酮，优选选自H、甲氧基、氨基、羧基或吡咯烷二酮。按照本专利技术，所述的具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有吡啶‑联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，其特征在于，该螯合剂的结构式如式1所示：

【技术特征摘要】
1.一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，其特征在于，该螯合剂的结构式如式1所示：其中，R1选自OH、NH2、n选自1～10的整数；R2、R3彼此独立地选自H、取代或未取代的烷基、烷氧基、卤素、取代或未取代的氨基、硝基、取代或未取代的酰胺基、羧基、酯基、取代或未取代的吡咯烷二酮。2.根据权利要求1所述的一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，其特征在于，n选自1～5的整数。3.根据权利要求1所述的一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，其特征在于，所述的R2、R3彼此独立地选自H、甲氧基、氨基、羧基或吡咯烷二酮。4.根据权利要求1-3任何一项所述的一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，其特征在于，所述的具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，该螯合剂的结构式如式Ⅰ至III所示：5.根据权利要求1所述的一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：步骤一：2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯的合成将溶剂、Li2CO3和N,N',N,N'-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二胺加入到反应瓶中回流1-3h，然后滴加2-(2,6-二溴甲基吡啶-4-氧基)乙酸乙酯溶液，继续回流30-60h，冷却至室温，过滤、减压浓缩后过硅胶柱层析纯化,得到2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯；步骤二：2-{2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-氧基}乙酸乙酯-Eu3+的合成将步骤一得到的2-{2,6-{...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘利华，常宇，王杰，曹雪，陈华鑫，崔恩超，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22