一种穴状螯合剂及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种穴状螯合剂及其制备方法，属于均相荧光免疫分析技术领域。该螯合剂的结构式如式1所示。该结构是在吡啶4位上引入单连接基团用于蛋白质标记，该结构有利于减少标记过程的非特异性反应。该螯合剂具有热稳定性和动力学螯合稳定性、有合适的激发波长、发射波长，能与稀土离子实行能量转移的三重态和允许在螯合剂和生物分子之间形成共价连接的功能基团，并具有较长的荧光寿命。本发明专利技术还提供了一种穴状螯合剂的制备方法。本发明专利技术的螯合剂激发光谱波长范围为258‑356nm，最大激发波长为331nm；铕离子特征的荧光光谱峰595、612nm，615nm，荧光寿命＞800μs。

A Point Chelating Agent and Its Preparation Method

The invention provides an acupoint chelating agent and a preparation method thereof, belonging to the field of homogeneous fluorescence immunoassay technology. The structural formula of the chelating agent is shown in Formula 1. The structure introduced a single ligand at the 4 position of pyridine for protein labeling, which was beneficial to reduce the nonspecific reaction of the labeling process. The chelating agent has thermal and kinetic chelating stability, suitable excitation wavelength and emission wavelength, triplet state of energy transfer with rare earth ions, functional groups that allow covalent bonding between chelating agent and biological molecules, and long fluorescence lifetime. The invention also provides a preparation method of a hole chelating agent. The excitation spectrum wavelength of the chelating agent is 258 356 nm, and the maximum excitation wavelength is 331 nm. The fluorescence spectrum peaks of Europium ion characteristics are 595, 612, 615 nm, and the fluorescence lifetime is over 800 Mu s.

【技术实现步骤摘要】
一种穴状螯合剂及其制备方法
本专利技术属于均相荧光免疫分析
，具体涉及一种穴状螯合剂及其制备方法。
技术介绍
均相免疫分析是一种不需通过反复冲洗来分离结合与游离标记物，在液相中可直接测量的分析方法。此方法操作简便，快速，易于实现自动化操作，故长期以来成为免疫分析方法学研究追求的主要目标之一。Boguslaski等曾用荧光染料代替酶标记均相免疫分析方法。但液相产生Raman散射及其大分子产生的300-600nm的本底荧光，与测量荧光波长大部分相重叠，且其荧光寿命在1-50ns，降低了信/噪比，使分析的灵敏度降低。均相免疫分析的灵敏度还有一个限制因素是其测量信号依赖加入启动剂或淬灭剂产生的测量信号或清除测量信号，这种机制难以提供足够强的测量信号。将能量转移的理论与时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术相结合，称之为均相TRFIA,为解决上述两个问题提供了新的途径。均相TRFIA具备了高灵敏性及高度稳定性分析特点。而要达到这些要求的关键是“理想”的螯合剂。这样的螯合剂的三重态能量水平要高，其发射波长要与受体激发波峰相重叠，此外也要具备通常稀土螯合剂的特点，如高发光效率，动力稳定性，与稀土离子高强度结合能力，排除水分子和淬灭的能力以及以生物大分子偶联后尽可能保持其生物活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种穴状螯合剂及其制备方法，该螯合剂具有热稳定性和动力学螯合稳定性，荧光寿命长。本专利技术首先提供一种穴状螯合剂，该螯合剂的结构式如式1所示：其中，R1选自OH、NH2、n选自1～10的整数；R2选自H、取代或未取代的烷基、烷氧基、卤素、取代或未取代的氨基、硝基、取代或未取代的酰胺基、羧基、酯基。优选的是，所述的n选自2～5的整数；优选的是，所述的R2选自H、甲氧基、氨基或羧基。优选的是，所述穴状螯合剂的结构式如式Ⅰ至III所示：本专利技术还提供穴状螯合剂的制备方法，该方法包括：步骤一：将溶剂、N,N',N,N'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺、Li2CO3加入到反应瓶中，回流0.5-1.5h，然后滴加6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯溶液,继续后反应30-50h,冷却至室温，反应液抽滤，旋蒸,进行柱层析分离得第一中间体；步骤二：将溶剂、步骤一得到的第一中间体加入到反应瓶中，再将EuCl3溶液加入，搅拌回流，继续反应20-40h，冷却至室温，得到第二中间体；步骤三：将步骤二得到的第二中间体在碱性条件下水解，或者加入胺类化合物反应，得到穴状螯合剂。优选的是，所述步骤一中N,N',N,N'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺与6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯摩尔比为1:(1～2.5)。优选的是，所述步骤二中溶剂为甲醇。优选的是，所述步骤二中第一中间体与EuCl3摩尔比为1:(1～3)。优选的是，所述步骤三的碱性水解条件为3～6h。优选的是，所述的步骤三的反应温度为-30～0℃，反应时间为4～10h。本专利技术的有益效果本专利技术提供一种穴状螯合剂，该螯合剂的结构式如式1所示，所述的穴状结构的螯合剂,在吡啶4位上引入单连接基团用于蛋白质标记，该结构有利于减少标记过程的非特异性反应，从而提高检测体系的灵敏度。该螯合剂具有热稳定性和动力学螯合稳定性、有合适的激发波长、发射波长，能与稀土离子实行能量转移的三重态和允许在螯合剂和生物分子之间形成共价连接的功能基团，并具有较长的荧光寿命。实验结果表明：本专利技术的螯合剂激发光谱波长范围为258-356nm，最大激发波长为331nm；铕离子特征的荧光光谱峰595、611nm，615nm，荧光寿命﹥800μs。本专利技术还提供了一种穴状螯合剂的制备方法，该制备方法简单、原料易得，将制备得到的螯合剂标记牛血清白蛋白(BSA)标记物的激发光谱、发射光谱及荧光寿命，为螯合剂用于均相时间分辨荧光免疫分析提供了依据。附图说明图1为本专利技术实施例1制备得到的C4的质谱图；图2为本专利技术实施例1制备得到的螯合剂C6的质谱图；图3为本专利技术实施例5制备的螯合剂C6水溶液的荧光光谱；图4为本专利技术实施例5制备得到的螯合剂C6的荧光寿命图；图5为本专利技术实施例14制备得到的BSA-C8标记物的荧光光谱；图6为本专利技术实施例14制备得到的BSA-C8标记物的荧光寿命图。具体实施方式本专利技术首先提供一种穴状螯合剂，该螯合剂的结构式如式1所示：其中，R1选自OH、NH2、n选自1～10的整数；优选为2～5的整数；R2选自H、取代或未取代的烷基、烷氧基、卤素、取代或未取代的氨基、硝基、取代或未取代的酰胺基、羧基、酯基，优选为H、甲氧基、氨基或羧基。按照本专利技术，所述穴状螯合剂的结构式如式Ⅰ至III所示：按照本专利技术，所述的螯合剂结构为联吡啶穴状螯合剂,在吡啶4位上引入蛋白质连接基团，有利于减少反应体系对荧光的淬灭，从而提高检测系统的灵敏度。该螯合剂具有热稳定性和动力学螯合稳定性、水溶性、有合适的激发波长、发射波长，能与稀土离子实行能量转移的三重态和允许在螯合剂和生物分子之间形成共价连接的功能基团，并具有较长的荧光寿命。本专利技术还提供穴状螯合剂的制备方法，该方法包括：步骤一：将溶剂、N,N',N,N'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺、Li2CO3加入到反应瓶中，回流0.5-1.5h，然后滴加6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯的溶液,继续后反应30-50h,冷却至室温，反应液抽滤，旋蒸,进行柱层析分离得第一中间体；所述的溶剂优选为乙腈，所述的N,N',N,N'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺与6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯摩尔比优选为1:(1-2.5)；更优选为1:(1.5-2)。所述的滴加时间优选为1-2.5h；具体反应如下：步骤二：将溶剂、步骤一得到的第一中间体加入到反应瓶中，再将EuCl3溶液加入，搅拌回流，继续反应20-40h，冷却至室温，得到第二中间体；所述步骤二中溶剂优选为甲醇，所述的第一中间体与EuCl3摩尔比优选为1:(1～3)，更优选为1：2；反应如下：步骤三：将步骤二得到的第二中间体在碱性条件下水解，或者加入胺类化合物反应，得到穴状螯合剂。按照本专利技术，所述的碱性条件下水解优选为：将第二中间体溶于CH3OH后加入反应瓶中，搅拌的状态下加入1-2mol/L的LiOH水溶液进行水解，所述的水解时间优选为3-6h，更优选为3.5h，将反应液用甲醇清洗后倒入烧杯中在80-90℃加热蒸干，得黄色固体水洗烘干，再用甲醇、四氢呋喃溶解析出，真空干燥，获得螯合剂。按照本专利技术，所述的加入胺类化合物进行反应，优选是将第二中间体溶于极性溶剂中，然后加入胺类化合物进行反应，所述的反应温度优选为-30～0℃，反应时间优选为4～10h；将反应产物进行离心、干燥，用HPLC-MS分离纯化。所述的第二中间体和胺类化合物的摩尔比优选为1：(1～15)，更优选为1：(5～6)；所述极性溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇或乙腈中的至少一种。反应如下：下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细的说明，实施例中涉及到的原料均为商购。实施例1螯合剂式Ⅰ的制备将化合物N,N',N,N'-[二(2,2’-联吡啶-6,6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种穴状螯合剂，其特征在于，该螯合剂的结构式如式1所示：

【技术特征摘要】
1.一种穴状螯合剂，其特征在于，该螯合剂的结构式如式1所示：其中，R1选自OH、NH2、n选自1～10的整数；R2选自H、取代或未取代的烷基、烷氧基、卤素、取代或未取代的氨基、硝基、取代或未取代的酰胺基、羧基、酯基。2.根据权利要求1所述的一种穴状螯合剂，其特征在于，所述的n选自2～5的整数。3.根据权利要求1所述的一种穴状螯合剂，其特征在于，所述的R2选自H、甲氧基、氨基或羧基。4.根据权利要求1-3任何一项所述的一种穴状螯合剂，其特征在于，所述穴状螯合剂的结构式如式Ⅰ至III所示：。5.根据权利要求1所述的一种穴状螯合剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：步骤一：将溶剂、N,N',N,N'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二胺、Li2CO3加入到反应瓶中，回流0.5-1.5h，然后滴加6,6′-二溴二甲基-2,2′-联吡啶-4-羧酸甲酯溶液,继续后反应30-50h,冷却至室温，反应液抽滤，旋蒸,进行柱层析分离得第一中间体；步骤二：将溶剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘利华，常宇，王杰，陈华鑫，曹雪，崔恩超，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22