用于稳定细胞外核酸的已灭菌组合物的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种制备适用于稳定生物样品的细胞外核酸群体的已灭菌组合物的方法。还提供了可灭菌组合物，其中已灭菌形式的该组合物适用于稳定生物样品的细胞外核酸群体。还提供了其他有用的方法、装置、试剂盒和用途。在此描述的其他可灭菌和已灭菌组合物也适合于稳定细胞内核酸(例如细胞内DNA如基因组DNA和/或细胞内RNA)和细胞特征，例如细胞表面蛋白和/或细胞形态。

Preparation method of sterilized composition for stabilizing extracellular nucleic acids

The invention provides a method for preparing a sterilized composition suitable for stabilizing the extracellular nucleic acid group of biological samples. A sterilable composition is also provided, wherein the sterilized form is applied to stabilizing extracellular nucleic acid groups of biological samples. Other useful methods, devices, kits and uses are also provided. Other sterilized and sterilized compositions described herein are also suitable for stabilizing intracellular nucleic acids (e.g., intracellular DNA, such as genomic DNA and / or intracellular RNA) and cell characteristics, such as cell surface proteins and / or cell morphology.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于稳定细胞外核酸的已灭菌组合物的制备方法本专利技术提供了一种制备适用于稳定生物样品的细胞外核酸群体的已灭菌组合物的方法。还提供了可灭菌组合物，其中已灭菌形式的所述组合物适用于稳定生物样品的细胞外核酸群体。还提供了其他有用的方法、装置、试剂盒和用途。具体地说，提供了适用于稳定含细胞样品例如血液样品的可灭菌和已灭菌组合物。在实施方式中，这些组合物适用于稳定细胞内核酸(例如细胞内DNA和/或细胞内RNA)、细胞表面特征和/或细胞形态。已在血液、血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，因为它们受到保护而免受核酸酶影响(例如，因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白质结合或包含在囊泡中)这一事实，因此具有一定程度的抗降解性。在许多医学状况、恶性肿瘤和感染过程中存在细胞外核酸例如DNA和/或RNA水平的改变例如升高是令人感兴趣的，尤其是对于筛查、诊断、预后、监测疾病进展、鉴定潜在治疗靶点和监测治疗反应而言。此外，母体血液中胎儿DNA/RNA的升高正被用于确定例如性别认同、评估染色体异常、和监测妊娠相关并发症。因此，细胞外核酸特别可用于非侵入性诊断和预后并且可在许多应用领域例如非侵入性产前基因检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作例如诊断标志物，并因此具有诊断相关性(例如胎儿或肿瘤来源的核酸)。然而，细胞外核酸也见于健康的人类中。除源自于例如肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸外，含细胞样品也可以包含未包含在细胞中的其他目标核酸。重要的非限制性实例是病原体核酸例如病毒核酸。在运输和处理期间保留含细胞样品中、例如特别是血液样品中的病毒核酸的完整性，对于后续的分析和病毒载量监测也是至关重要的。在例如以下文献中描述了细胞外核酸的常见应用和分析方法：WO97/035589，WO97/34015，Swarup等人，FEBSLetters581(2007)795-799，FleischhackerAnn.N.Y.Acad.Sci.1075：40-49(2006)，Fleischhacker和Schmidt，BiochmicaetBiophysicaActa1775(2007)191-232，Hromadnikova等人(2006)DNAandCellbiology，第25卷，第11期，第635-640页；Fan等人(2010)ClinicalChemistry56：8。尽管细胞外核酸的分析令人高度感兴趣，但由于若干原因，发现它们的分析是困难的。样品中通常只包含低浓度的细胞外核酸。此外，细胞外核酸经常作为大小为500nt、300nt(当指示大小并由此指示链长时，术语“nt”在DNA的情况下也包括“bp”)或甚至更小(循环核小体)的片段循环。对于血浆中的循环的无细胞DNA(ccfDNA)而言，平均长度经常仅为约140-170bp。另外，被认为是为了诊断目的而鉴定的实际靶细胞外核酸通常也只占总细胞外核酸当中的一小部分。关于ccfDNA，取决于例如妊娠状态或肿瘤分级，每ml血液通常只存在数千个可扩增的拷贝。具体来说，肿瘤特异性DNA片段非常罕见，并且所包含的浓度经常比“正常”细胞外核酸背景低1000-倍。这种低浓度对于样品的稳定化和随后从被稳定的样品中分离细胞外核酸提出了挑战。此外，除了在血清以及可能还有血浆中发生的降解之外，与循环的无细胞核酸(cfNA)例如来自肿瘤的或胎儿来源的cfNA的分析相关的主要问题是：在样品采集后，细胞外DNA(和RNA)可能被来自损伤或衰变细胞的遗传物质稀释。采集样品后，在离体温育期间，通常在样品采集后相对短的时间内，由于细胞破碎而使细胞核酸从样品中含有的细胞中释放。一旦细胞裂解开始，裂解的细胞就释放出大量额外的核酸，所述核酸变成与所述细胞外核酸混合，而回收细胞外核酸进行测试就变得越来越困难。如果样品包含大量细胞，正如例如用全血样品的情况那样，则样品采集后细胞内核酸的释放特别是个问题。关于血液样品，特别是白细胞的裂解是个问题，因为它们除了释放RNA之外还释放大量的基因组DNA。红细胞不含基因组DNA。因此，全血中循环核酸的稳定化必须包括稳定血细胞的机制，以便在稳定化期间防止细胞外核酸群体被细胞基因组DNA以及还有RNA污染。具体来说，细胞外核酸、特别是稀有的靶细胞外核酸的稀释是个问题，并且必须予以防止。现有技术中讨论了这些问题(参见例如，Chiu等人(2001)，ClinicalChemistry47：91607-1613；Fan等人(2010)和US2010/0184069)。此外，可用的细胞外核酸的量和可回收性可在一段时间后由于降解而显著减少。为了解决这些问题以及对有效稳定细胞外核酸的需求，已经开发了许多用于稳定细胞外核酸群体的方法、组合物和装置。US7,332,277、US7,442,506和US2011/0111410中描述了使用甲醛或甲醛释放剂进行稳定化。在例如US2010/0184069和US2010/0209930中也描述了稳定血液样品的方法。然而，使用甲醛或甲醛释放物质有缺点。甲醛是有毒的。而且，这些稳定剂可以化学修饰生物分子如蛋白质和核酸。因此它们可以通过诱导核酸分子之间或蛋白质与核酸之间的交联来危害细胞外核酸分离的效能。这尤其可减少可扩增或可得到以用于诊断的核酸分子的数量。由于血浆中ccfDNA的数量限于每毫升血液仅数几千个拷贝，这是一个巨大的缺点。除了细胞外核酸之外，其他核酸也是诊断领域中的重要生物标志物。例如，基因组的转录物(特别是mRNA和miRNA)谱被广泛用作分子体外诊断中的生物标志物，并提供对正常的生物和病理过程的了解，以期预测疾病后果并指示个体化治疗过程。因此，核酸、特别是RNA的谱型分析在疾病诊断、预后和在用于生物标志物发现的临床试验中是重要的。然而，如果在待分析样品的稳定化方面没有预防措施，则样品在运输和储存期间将经历变化，这可能严重改变靶分子的表达谱(参见例如Rainen等人，2002；Baechler等人，2004)。因此，基因表达、特别是血细胞基因表达对样品的离体处理是敏感的。如果由于处理样品而改变了表达谱，则后续分析不能反映样品的原始状况，因此也不反映患者的原始状况，而是测量了样品处理、运输和储存期间产生的人工谱。因此，需要优化的稳定化方法来稳定表达谱，从而允许可靠的分析。特别是，需要稳定血液样品以便允许分析血细胞基因表达谱。许多用于稳定表达谱的已知技术是基于细胞裂解的(例如PAXgene血RNA管，US6,617,170，US7,270,953，Kruhoffer等人，2007)。各种方法的缺点是该稳定化导致细胞完全裂解。细胞的破坏导致细胞内核酸变得与细胞外核酸混合，这妨碍了对这两个核酸群体进行单独的分析。而且，细胞的破坏使得任何细胞分选或细胞富集分别不可能进行细胞分析。因此，对于某些应用，需要样品采集和稳定化系统，其保留细胞的形态，同时稳定核酸。为了解决对同时细胞稳定化和核酸稳定化的需求，开发了基于甲醛释放剂的使用的稳定化体系(例如无细胞RNABCT(采血管(bloodcollectiontube)))，US2011/0111410)。然而，从相应被稳定的样品分离核酸非常困难，因为所使用的甲醛释放剂干扰后续的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制造适用于稳定生物样品的细胞外核酸群体的已灭菌组合物的方法，所述方法包括：a)提供一种组合物，其包含：i.至少一种半胱天冬酶抑制剂，和ii.至少一种选自硫醇、水溶性维生素、和水溶性维生素E衍生物的化合物，所述硫醇是N‑乙酰半胱氨酸或谷胱甘肽；以及b)辐照所述组合物进行灭菌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.20 EP 15195656.2;2016.04.05 EP 16163863.01.一种制造适用于稳定生物样品的细胞外核酸群体的已灭菌组合物的方法，所述方法包括：a)提供一种组合物，其包含：i.至少一种半胱天冬酶抑制剂，和ii.至少一种选自硫醇、水溶性维生素、和水溶性维生素E衍生物的化合物，所述硫醇是N-乙酰半胱氨酸或谷胱甘肽；以及b)辐照所述组合物进行灭菌。2.根据权利要求1所述的方法，其中辐照所述组合物进行灭菌具有以下特征中的一个或多个：a)通过电离辐照来辐照所述组合物；b)通过γ辐照、电子束辐照或X射线来辐照所述组合物；c)通过γ辐照或X射线来辐照所述组合物；d)通过γ辐照来辐照所述组合物；e)以5kGy至35kGy、6kGy至30kGy、7kGy至26kGy、约8kGy至约25kGy、或约8kGy至约15kGy的辐照剂量来辐照所述组合物；f)以5kGy至35kGy、6kGy至30kGy、7kGy至26kGy、约8kGy至约25kGy、或约8kGy至约15kGy的辐照剂量通过γ辐照来辐照所述组合物；g)以8kGy至25kGy、或8kGy至15kGy的辐照剂量通过γ辐照来辐照所述组合物；和/或h)辐照灭菌导致所述组合物的无菌性保证水平(SAL)为10-6或更低。3.根据权利要求1至2中的一项或多项所述的方法，其中所述组合物具有以下特征中的一个或多个：a)所述组合物以固体形式制备；b)所述组合物以固体形式制备并在辐照前溶解以提供液体组合物，所述液体组合物优选是含水的；d)所述组合物以液体形式制备和辐照；e)所述组合物是含水的；f)所述组合物具有酸性pH；g)所述组合物具有pH4.0至7.0、pH4.1至6.9、pH4.2至6.8、pH4.3至6.6、pH4.4至6.3、pH4.5至6.0、或pH4.5至5.5，和/或h)所述组合物是经缓冲的。4.根据权利要求1至3中的一项或多项所述的方法，其包含辐照液体形式、优选含水形式的所述组合物。5.根据权利要求1至4中的一项或多项所述的方法，其中所述组合物包含浓度小于20mg/ml、15mg/ml或更低、10mg/ml或更低、7mg/ml或更低、3mg/ml或更低、或1.5mg/ml或更低的所述至少一种选自硫醇、水溶性维生素、和水溶性维生素E衍生物的化合物，所述硫醇是N-乙酰半胱氨酸或谷胱甘肽。6.根据权利要求1至5中的一项或多项所述的方法，其中所述组合物包含i.选自N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、B族维生素、抗坏血酸和trolox的化合物，其中所述谷胱甘肽优选是还原形式，所述B族维生素优选是维生素B6；ii.选自N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、抗坏血酸和trolox的化合物，其中所述谷胱甘肽优选是还原形式；iii.选自N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、B族维生素、和抗坏血酸的化合物，其中所述谷胱甘肽优选是还原形式，所述B族维生素优选是维生素B6；iv.选自N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽和抗坏血酸的化合物，其中所述谷胱甘肽优选是还原形式；或v.N-乙酰半胱氨酸。7.根据权利要求1至6中的一项或多项所述的方法，所述方法包括：a)提供一种组合物，其包含：i.至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选如权利要求13中限定的，和ii.下列中的至少一种aa)N-乙酰半胱氨酸，浓度为0.05mg/ml至15mg/ml、0.1mg/ml至10mg/ml、0.1mg/ml至7.5mg/ml、0.1mg/ml至5mg/ml、0.1mg/ml至2mg/ml、0.2mg/ml至1mg/ml、或0.3mg/ml至0.8mg/ml；ab)谷胱甘肽，浓度为0.03mg/ml至10mg/ml、0.075mg/ml至5mg/ml、0.15mg/ml至4mg/ml、或0.4mg/ml至1.3mg/ml，其中所述谷胱甘肽优选是还原形式；ac)抗坏血酸，浓度小于20mg/ml，例如0.1mg/ml至15mg/ml、1mg/ml至13mg/ml、1.5mg/ml至12mg/ml、或2mg/ml至11mg/ml；ad)B族维生素，优选维生素B6，浓度为0.1mg/ml至15mg/ml、0.1mg/ml至14mg/ml、0.1mg/ml至11mg/ml、0.2mg/ml至7.5mg/ml、或0.2mg/ml至2mg/ml；ae)trolox，浓度为0.5mg/ml至5mg/ml、0.75mg/ml至3mg/ml、0.9mg/ml至2mg/ml、或1mg/ml至1.4mg/ml；以及b)辐照所述组合物进行灭菌，其中优选地，所述组合物包含浓度如aa)中限定的N-乙酰半胱氨酸。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述组合物以液体形式、优选含水形式被辐照和/或其中所述组合物通过γ辐照进行辐照灭菌。9.根据权利要求1至8中的一项或多项所述的方法，其中所述组合物具有以下特征中的一个或多个：a)所述组合物包含N-乙酰半胱氨酸；b)所述组合物包含浓度为0.05mg/ml至15mg/ml、0.1mg/ml至10mg/ml、0.1mg/ml至7.5mg/ml、0.1mg/ml至5mg/ml、0.1mg/ml至2mg/ml、0.2mg/ml至1mg/ml、或0.3mg/ml至0.8mg/ml的N-乙酰半胱氨酸；c)所述组合物包含N-乙酰半胱氨酸，并以液体形式、优选含水形式通过辐照进行灭菌；和/或d)所述组合物包含浓度为0.05mg/ml至15mg/ml、0.1mg/ml至10mg/ml、0.1mg/ml至7.5mg/ml、0.1mg/ml至5mg/ml、0.1mg/ml至2mg/ml、0.2mg/ml至1mg/ml、或0.3mg/ml至0.8mg/ml的N-乙酰半胱氨酸，并以含水的液体形式灭菌。10.根据权利要求1至9中的一项或多项所述的方法，其中所述组合物具有以下特征中的一个或多个：a)所述组合物包含谷胱甘肽；b)所述组合物包含还原形式的谷胱甘肽；c)所述组合物包含浓度为0.03mg/ml至10mg/ml、0.075mg/ml至5mg/ml、0.15mg/ml至4mg/ml、或0.4mg/ml至1.3mg/ml的谷胱甘肽，其中所述谷胱甘肽优选是还原形式；d)所述组合物包含谷胱甘肽并以液体形式、优选含水形式灭菌，其中所述谷胱甘肽优选是还原形式；和/或e)所述组合物包含浓度为0.03mg/ml至10mg/ml、0.075mg/ml至5mg/ml、0.15mg/ml至4mg/ml、或0.4mg/ml至1.3mg/ml的谷胱甘肽并以含水的液体形式灭菌，其中所述谷胱甘肽优选是还原形式。11.根据权利要求1至10中的一项或多项所述的方法，其中所述组合物具有以下特征中的一个或多个：a)所述组合物包含至少一种水溶性维生素，其中优选所述水溶性维生素选自抗坏血酸、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、叶酸盐或叶酸、维生素B12、生物素和泛酸，更优选其中所述组合物包含抗坏血酸；b)所述组合物包含浓度小于20mg/ml，例如0.1mg/ml至15mg/ml、1mg/ml至13mg/ml、1.5mg/ml至12mg/ml、或2mg/ml至11mg/ml的至少一种水溶性维生素，优选选自抗坏血酸、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、叶酸盐或叶酸、维生素B12、生物素和泛酸，更优选抗坏血酸；c)所述组合物包含至少一种水溶性维生素并以液体形式、优选含水形式灭菌；d)所述组合物包含抗坏血酸并以液体形式、优选含水形式灭菌；e)所述组合物包含浓度小于20mg/ml，例如0.1mg/ml至15mg/ml、1mg/ml至13mg/ml、1.5mg/ml至12mg/ml或2mg/ml至11mg/mlmg/ml的至少一种水溶性维生素，并以液体形式、优选含水形式灭菌；f)所述组合物包含浓度小于20mg/ml的抗坏血酸，其中所述浓度能选自0.1mg/ml至15mg/ml、1mg/ml至13mg/ml、1.5mg/ml至12mg/ml、或2mg/ml至11mg/ml，并且其中所述组合物以液体形式、优选含水形式通过辐照进行灭菌；g)所述组合物包含浓度为0.1mg/ml至15mg/ml、0.1mg/ml至14mg/ml、0.1mg/ml至11mg/ml、0.2mg/ml至7.5mg/ml、或0.2mg/ml至2mg/ml的B族维生素，优选维生素B6；和/或h)所述组合物包含浓度为0.1mg/ml至15mg/ml、0.1mg/ml至14mg/ml、0.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·格勒尔兹，安德烈埃·由立乌斯，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE