抗蛋白酶的链霉亲和素制造技术

本发明专利技术涉及一种抗Lys‑C或其他蛋白酶切割的改性的链霉亲和素分子。这些改性的链霉亲和素分子可以通过化学修饰天然链霉亲和素、通过化学合成或通过基因工程来制备。本发明专利技术还涉及编码这些改性的链霉亲和素分子的核酸分子，涉及包含这些核酸分子的载体，以及涉及包含这些核酸分子或载体的细胞。本发明专利技术进一步涉及一种包含改性的链霉亲和素分子的固相载体和试剂盒。本发明专利技术还涉及这些改性的链霉亲和素分子或这些固相载体在捕获/固定蛋白质、肽、寡核苷酸(例如适体)、多核苷酸(例如DNA，RNA或PNA)、脂质、(多)糖、碳水化合物、代谢物、药物和小分子、天然分子和合成分子中的用途，以及涉及这些改性的链霉亲和素分子或这些固相载体在质谱分析中用于鉴定与前述(生物)分子相互作用的蛋白质的用途。本发明专利技术还涉及一种通过使用改性的链霉亲和素分子来降低质谱分析背景的方法。

Protease resistant streptomycin

The invention relates to a modified streptavidin molecule which is resistant to cleavage of Lys C or other proteases. These modified streptavidin molecules can be prepared by chemical modification of natural streptavidin, by chemical synthesis or by genetic engineering. The invention also relates to nucleic acid molecules encoding these modified streptomycin molecules, involving carriers containing these nucleic acid molecules, and cells involving these nucleic acid molecules or carriers. The invention further relates to a solid carrier and kit containing modified streptavidin molecules. The invention also relates to these modified streptomycin molecules or these solid carriers in capturing / immobilizing proteins, peptides, oligonucleotides (such as suitable bodies), polynucleotides (such as DNA, RNA or PNA), lipids, carbohydrates, metabolites, drugs and fractions, natural molecules and synthetic molecules, as well as the use of these carriers, as well as the use of these carriers, as well as the use of natural molecules and synthetic molecules. These modified streptavidin molecules or these solid phase carriers are used for identification of proteins interacting with the above mentioned molecules in mass spectrometry. The invention also relates to a method for reducing the background of mass spectrometry by using modified streptavidin molecules.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗蛋白酶的链霉亲和素
本专利技术涉及抗Lys-C或其他蛋白酶切割的经改性的链霉亲和素分子。这些改性的链霉亲和素分子可以通过对天然的链霉亲和素化学修饰、通过化学合成或通过基因工程来来制备。本专利技术还涉及编码这些改性的链霉亲和素分子的核酸分子，涉及包括这些核酸分子的载体，以及涉及包含这些核酸分子或载体的细胞。本专利技术进一步涉及包括所述改性的链霉亲和素分子的固相载体和试剂盒。本专利技术还涉及这些改性的链霉亲和素分子或这些固相载体在捕获/固定蛋白质、肽、寡核苷酸(例如适体)、多聚核苷酸(DNA、RNA或PNA)、脂质、(多)糖、碳水化合物、代谢物、药物和小分子、天然分子和合成分子中的用途，和涉及所述改性的链霉亲和素分子或所述固相载体在质谱分析中用于鉴定与上述(生物)分子相互作用的蛋白质的用途。本专利技术进一步涉及一种通过使用所述改性的链霉亲和素分子来降低质谱分析中的背景的方法。
技术介绍
质谱分析是在蛋白质分析中的一种确定的方法。然而，对于质谱分析来说，全长蛋白通常太大。因此，全长蛋白通常会用蛋白酶消化以获得适合分析的较小片段。目前的专利技术人通常采用用生物素标记待分析的靶蛋白的方案。利用生物素和链霉亲和素之间的强亲和力通过亲和层析来纯化生物素化的蛋白质。这是通过使用具有共价连接了链霉亲和素的载体材料的亲和柱或通过使用共价连接了链霉亲和素的珠子来实现的。为了生成适合于质谱分析的蛋白质片段，在生物素化的靶蛋白与链霉亲和素结合时，或者在将生物素化的蛋白质从这些柱子或载体洗脱之后，可以将蛋白酶(例如LysC或胰蛋白酶)直接应用于亲和柱或珠子。然而，蛋白水解消化不仅能够切割靶蛋白，而且能够切割共价结合到载体材料或珠子上的链霉亲和素。链霉亲和素的蛋白水解片段在随后的质谱分析中形成不期望的背景。即使在蛋白酶处理之前，将所述链霉亲和素从珠子/载体上洗脱，也经常会观察到链霉亲和素蛋白片段的背景，因为尽管存在共价连接，链霉亲和素依然会从珠子/载体上泄漏出来。据推测，发生泄漏是因为链霉亲和素是四聚体，而其中只有一个亚基共价连接到珠子或载体材料上。专利技术人还采用了一种实验方案来鉴定与感兴趣的分子相互作用的蛋白质。为此，用生物素标记感兴趣的分子并使其结合到共价连接了链霉亲和素的载体材料或珠子上。然后使含有潜在的相互作用配体的样品与载体材料或珠子接触，以捕获潜在的蛋白质相互作用配体。然后蛋白质相互作用可以进行蛋白水解消化(任选地，在从载体材料或珠子上洗脱之后)，并且可以通过质谱分析来分析所述蛋白水解片段。无论蛋白水解消化是在珠子/载体上进行，还是在蛋白相互作用配体洗脱后进行，经常都能再次观察到不期望的链霉亲和素片段的背景。本专利技术的技术问题本专利技术的专利技术人现在已经找到了一种制备能够抗蛋白酶切割(尤其是抗LysC和/或胰蛋白酶切割)的改性的链霉亲和素分子的方法，同时仍然维持对生物素的高结合亲和力。本专利技术的新型改性的链霉亲和素非常适用于蛋白质纯化中，尤其适用于随后通过质谱分析进行的蛋白质鉴定中。然而，新型的改性的链霉亲和素可以有利地应用于需要具有对生物素的高结合亲和力的、稳定的(即抗蛋白酶)链霉亲和素的其他方法中。以上概述不必然描述本专利技术所解决的所有问题。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及改性的链霉亲和素，其(i)抗至少一种内肽酶的切割，其中所述至少内肽酶对碱性氨基酸是特异性的；和(ii)呈现出10-10M或更小的对生物素的解离常数KD。在第二方面，本专利技术涉及核酸分子，其包含编码根据第一方面的改性的链霉亲和素的核苷酸序列。在第三方面，本专利技术涉及载体，其包含第二方面的核酸分子。在第四方面，本专利技术涉及细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的载体。在第五方面，本专利技术涉及固相载体，其包含第一方面的改性的链霉亲和素。在第六方面，本专利技术涉及试剂盒，其包含第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体，并且进一步包括至少一种蛋白酶，所述蛋白酶选自LysC、LysN、ArgC和胰蛋白酶。在第七方面，本专利技术涉及第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体或第六方面的试剂盒用于捕获或固定至少一种生物素化分子的用途。在第八方面，本专利技术涉及第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体或第六方面的试剂盒用于蛋白质纯化的用途。在第九方面，本专利技术涉及第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体或第六方面的试剂盒在质谱分析中的用途。在第十方面，本专利技术涉及用于减少质谱分析中的背景的方法，其包括以下步骤：(i)提供携带有根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；(ii)使包含生物素化蛋白质的样品与步骤(i)的所述珠子接触，从而使生物素化蛋白质结合至改性的链霉亲和素；(iii)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；(iv)将包含蛋白酶的溶液添加至珠子，从而生成生物素化蛋白质的肽段；(v)回收步骤(iv)中产生的肽段；和(vi)任选地，将步骤(v)中回收的肽段进行质谱分析。在第十一方面，本专利技术涉及用于减少质谱分析中的背景的方法，其包括以下步骤：(i)提供携带有根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；(ii)使包含生物素化蛋白质的样品与步骤(i)的珠子接触，从而使生物素化蛋白质结合至改性的链霉亲和素；(iii)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；(iv)洗脱生物素化蛋白质；(v)将包含蛋白酶的溶液添加至在步骤(iv)中洗脱的生物素化蛋白质，由此生成生物素化蛋白质的肽段；(vi)回收步骤(v)中产生的肽段；和(vii)任选地，将步骤(vi)中回收的肽段进行质谱分析。在第十二方面，本专利技术涉及用于捕获分子的蛋白质相互作用配体的方法，其包括以下步骤：(i)提供携带有根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；(ii)使生物素化分子与步骤(i)的珠子接触，从而将生物素化分子装载到珠子上；(iii)使样品与步骤(ii)中获得的装载有生物素化分子的珠子接触，其中所述样品包含生物素化分子的至少一种蛋白质相互作用配体；(iv)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；(v)将包含蛋白酶的溶液添加至珠子，从而生成所述至少一种蛋白质相互作用配体的肽段；(vi)回收步骤(v)中产生的肽段；和(vii)任选地，将步骤(v)中回收的肽段进行质谱分析。在第十三方面，本专利技术涉及用于捕获分子的蛋白质相互作用配体的方法，其包括以下步骤：(i)提供携带有根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；(ii)使生物素化分子与步骤(i)的珠子接触，从而将生物素化分子装载到珠子上；(iii)使样品与步骤(ii)中获得的装载有生物素化分子的珠子接触，其中样品包含生物素化分子的至少一种蛋白质相互作用配体；(iv)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；(v)洗脱所述至少一种蛋白质相互作用配体；(vi)将包含蛋白酶的溶液添加至步骤(v)中所洗脱的蛋白质相互作用配体中，由此生成所述至少一种蛋白质相互作用配体的肽段；(vii)回收步骤(vi)中产生的肽段；和(viii)任选地，将在步骤(vii)中回收的肽段进行质谱分析。在第十四方面，本专利技术涉及用于捕获染色质相关蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)提供待研究其染色质的细胞；(ii)向细胞中添加甲醛以交联染色质；(iii)剪切所述染色质样品，从而生成剪切的染色质样品；(iv)向步骤(iii)中交联的和剪切的染色质样品中添加对感兴趣的染色质相关蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改性的链霉亲和素，其(i)抗至少一种内肽酶的切割，其中所述至少一种内肽酶对碱性氨基酸是特异性的；和(ii)呈现出10‑10M或更小的对生物素的解离常数KD；其中所述至少一种内肽酶优选选自LysC、LysN、ArgC和胰蛋白酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.23 EP 15186564.91.一种改性的链霉亲和素，其(i)抗至少一种内肽酶的切割，其中所述至少一种内肽酶对碱性氨基酸是特异性的；和(ii)呈现出10-10M或更小的对生物素的解离常数KD；其中所述至少一种内肽酶优选选自LysC、LysN、ArgC和胰蛋白酶。2.根据权利要求1所述的改性的链霉亲和素，其中所述至少一种内肽酶选自LysC、LysN和胰蛋白酶，并且其中一个或更多个赖氨酸残基携带选自以下的至少一种化学修饰：(i)中和ε氨基的正电荷的化学修饰；和(ii)取代ε氨基的氢的化学修饰。3.根据权利要求2所述的改性的链霉亲和素，其中所述化学修饰是通过选自以下的化学反应生成的：(i)赖氨酸残基的酰化，其生成酰基-赖氨酸；(ii)赖氨酸残基的还原烷基化，其生成二烷基-赖氨酸；(iii)赖氨酸残基与丙酸酐的反应，其生成丙酰赖氨酸；(iv)赖氨酸残基与琥珀酸酐的反应，其生成赖氨酸二羧酸酐；(v)赖氨酸残基的烷基化，其生成烷基-赖氨酸；(vi)赖氨酸残基的脒化反应，其生成赖氨酸的乙脒衍生物。4.根据权利要求1所述的改性的链霉亲和素，其中所述至少一种内肽酶选自LysC、LysN和胰蛋白酶，并且其中所述改性的链霉亲和素是根据SEQIDNO：2所示的野生型链霉亲和素氨基酸序列的突变蛋白质，其中所述突变蛋白质的特征在于在SEQIDNO：2的至少K121和K132位置处的氨基酸交换，并且其中所述突变蛋白质任选地包含1至10个内部氨基酸缺失、1至10个氨基酸插入、1至10个氨基酸交换、1至13个N端缺失、和/或1至20个C端缺失。5.根据权利要求4所述的改性的链霉亲和素，其中K121和K132彼此独立地被另一种氨基酸置换，其中所述另一种氨基酸既不是赖氨酸也不是精氨酸；其中优选地，置换K121或K132的氨基酸彼此独立地选自丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、乙酰鸟氨酸、乙酰氨基-甲基-半胱氨酸、O-乙酰氨基-甲基-高丝氨酸、S-乙酰氨基-甲基-高半胱氨酸、乙酰赖氨酸、丙酰赖氨酸、羟乙酰赖氨酸、单氟乙酰赖氨酸、二氟乙酰赖氨酸、三氟乙酰赖氨酸、巴豆酰基赖氨酸和二甲基赖氨酸。6.根据权利要求1至5中任一项所述的改性的链霉亲和素，其中所述至少一种内肽酶选自ArgC和胰蛋白酶，并且其中一个或更多个精氨酸残基携带选自以下的至少一种化学修饰：(i)中和胍基的正电荷的化学修饰；和(ii)取代胍基的一个或更多个氢的化学修饰。7.根据权利要求6所述的改性的链霉亲和素，其中所述化学修饰是通过选自以下的化学反应生成的：(i)精氨酸残基与二羰基化合物的反应，其生成改性的精氨酸残基；和(ii)精氨酸残基的氨甲酰化，其生成氨甲酰化的精氨酸。8.根据权利要求1、4或5中任一项所述的改性的链霉亲和素，其中所述至少一种内肽酶选自ArgC和胰蛋白酶，并且其中所述改性的链霉亲和素是根据SEQIDNO：2所示的野生型链霉亲和素氨基酸序列的突变蛋白质，其中所述突变蛋白质的特征在于SEQIDNO：2的R59、R84或R103位置上的一个或更多个氨基酸交换，并且其中所述突变蛋白质任选地包含1至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰伦·克里伊格斯菲尔德，穆罕默德雷扎·拉菲，
申请(专利权)人：欧洲分子生物学实验室，
类型：发明
国别省市：德国,DE