一种含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种二次固定化合成的含蛋白酶‑无机杂化纳米花的水凝胶型酶催化材料及其制备方法和应用。利用蛋白酶作为有机组分与无机金属离子通过自组装的方式合成蛋白酶‑无机杂化纳米花，然后将其包埋到生物相容性较好的含有至少两种亲水性聚合物的凝胶载体体系中，并通过反复冷冻‑解冻的方法制备得到含有蛋白酶‑无机杂化纳米花的水凝胶，其独特的三维网状结构使酶稳定存在于催化体系中，从而达到二次固定化的目的。本发明专利技术通过二次固定化，使蛋白酶免受外界环境的影响，从而使酶的稳定性得到了改善，进一步提高了酶的重复利用性。该催化材料无需与反应物进行分离，省去了酶与底物分离的步骤，在酶的固定化领域将有很广泛的应用前景。

Hydrogel containing protease inorganic hybrid nanomaterials and preparation method and application thereof

The invention discloses a hydrogel type enzyme catalyzed material with two times immobilized synthesis of protease and inorganic hybrid nanomaterials, and a preparation method and application thereof. Protease was synthesized by protease and inorganic metal ions by self-assembly, and then embedded into the gel carrier system containing at least two kinds of hydrophilic polymers with good biocompatibility, and the protease was prepared by repeated freezing method. Inorganic hybrid nanoscale hydrogels, whose unique three-dimensional network structure makes enzymes stable in catalytic systems, achieves the purpose of two immobilization. By two times immobilization, the protease is protected from the external environment, thus the stability of the enzyme is improved, and the reutilization of the enzyme is further improved. The catalytic material does not need to be separated from the reactants, eliminating the steps of separation of enzymes from substrates, and will have wide application prospects in the field of immobilization of enzymes.

【技术实现步骤摘要】
一种含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶及其制备方法和应用
本专利技术属于酶固定化领域，涉及一种二次固定化合成的含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶型酶催化材料及其制备方法和应用。
技术介绍
蛋白酶作为催化蛋白质水解的酶类，已经广泛地应用于生物化学、生物医药、食品、纺织、化工等领域。但由于大部分蛋白酶在强酸、强碱、高温和重金属离子的环境条件下容易遭到破坏，使酶的生产和应用受到极大的限制，因而如何提高酶的稳定性以及扩大酶的利用范围成为人们研究的热点。近几年来，国内外各方学者利用超分子组装的方法在合成具有三维花形结构的有机-无机杂化纳米花上取得了突破性的进展，这种方法将酶作为有机组分，金属离子作为无机组分，不但实现了酶的固定化，还极大地提高了酶的活性及稳定性，从而扩大了其在生物催化、生物传感、能源储存、气体检测、蛋白质组学分析等领域的应用潜力。然而，这种纳米花型催化材料的力学强度很低，容易受到外界环境或外力因素的影响从而导致稳定性降低，且需要离心才能将纳米花与底物分离，从而不利于工业化生产快速进行。同时，有很多国内外学者通过包埋的方法将酶固定化到生物相容性较好、热稳定较好、多孔的聚合物水凝胶中，如：海藻酸钠凝胶微球、石墨烯聚合物复合水凝胶、壳聚糖-黏土纳米复合膜、硅聚合物凝胶微球等等，从而改善了酶催化材料的力学性能，提高了酶的稳定性，然而遗憾的是固定化后酶的扩散受到极大地限制，同时还伴有少量的酶从聚合物凝胶中溶出的现象，从而使其酶活性损失较为严重。因此，找寻一种既能提高酶活又能保证酶稳定性的固定方法是极为重要的。
技术实现思路
目前蛋白酶作为工业催化剂的在实际应用过程中仍存在很多缺陷，且在纳米级固定化后酶活虽有提高，但易受外界环境影响出现稳定性降低的现象，从而极大地限制了其进一步的工业化应用，因此为了解决这一难题，本专利技术提供了一种二次固定化方法，将蛋白酶-无机杂化纳米花和壳聚糖-PVA等亲水性聚合物构成的水凝胶二者优异的性能充分的结合在一起，从而得到具有一定强度且兼具较高催化活性及稳定性的含酶-无机杂化纳米花的水凝胶型酶催化材料。本专利技术的技术方案如下：一种含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶，其包括：(a)蛋白酶和无机金属离子通过自组装而成的蛋白酶-无机杂化纳米花；以及(b)含有至少两种亲水性聚合物的凝胶载体体系。在上述技术方案中，其将所述的蛋白酶-无机杂化纳米花包埋到所述的凝胶载体体系中制备得到。在上述技术方案中，所述的亲水性聚合物为壳聚糖、聚乙烯醇、海藻酸钠、海藻酸钙、或琼脂糖。在上述技术方案中，所述的无机金属离子来源于氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的一种或多种。在上述技术方案中，蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶中的一种或几种。本专利技术还提供含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：(1)用水性溶液配制得到浓度为0.1～2mg/mL的蛋白酶溶液，加入无机金属离子溶液，在20～40℃下静置24～96小时，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到蛋白酶-无机杂化纳米花；(2)将至少两种亲水性聚合物溶于水性溶液中制备得到凝胶载体体系，加入步骤(1)得到的蛋白酶-无机杂化纳米花，室温搅拌混合；(3)步骤(2)的混合溶液，经循环冷冻和解冻的过程，得含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶。在上述的技术方案中，在步骤(2)中，所述的蛋白酶-无机杂化纳米花在所述的凝胶载体体系中的质量百分含量为1～5％。蛋白酶-无机杂化纳米花在凝胶载体体系中的质量百分含量影响纳米花在载体体系中的分散度，浓度过高，纳米花在凝胶中的分散性就会变差，从而影响酶与底物的充分结合，进而影响酶催化材料的活性。在上述的技术方案中，在步骤(2)中，可以采用至少两种亲水性聚合物溶于水性溶液中，制备得到稳定的凝胶载体体系。所述亲水性聚合物选自壳聚糖、聚乙烯醇、海藻酸钠、海藻酸钙、或琼脂糖。优选的，至少两种亲水性聚合物选自壳聚糖和聚乙烯醇、或海藻酸钠和聚乙烯醇、或海藻酸钙和聚乙烯醇、或琼脂糖和聚乙烯醇、或聚乙烯醇和其他两种以上聚合物组合的复合聚合物。在所述两种聚合物组成的聚合物组合中，聚乙烯醇在所述的凝胶载体体系中所加入的质量百分含量为10～20％，剩余聚合物如壳聚糖、海藻酸钠、海藻酸钙、或琼脂糖在所述的凝胶载体体系中所加入的质量百分含量为4～6％。在所述两种以上聚合物组合的复合聚合物中，所述的聚乙烯醇在所述的凝胶载体体系中所加入的质量百分含量为10～20％，剩余其他聚合物在所述的凝胶载体体系中所加入的质量百分含量为4～6％，其中不限定所述剩余其他聚合物所占的比例，总和在所述4～6％范围内时能够实现本专利技术。优选的，所述的壳聚糖的粘均分子量为620000±75000，所述的聚乙烯醇的聚合度为1750±50，所述的海藻酸钠粘均分子量为150000±35000，海藻酸钙的分子量为584.45，所述的琼脂糖分子量为630.55。在上述技术方案中，所述的水性溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)、水、或含有酸性物质或碱性物质的水性溶液，所述酸性物质为醋酸、盐酸等，所述碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾等。在上述的技术方案中，在步骤(3)中，所述冷冻的条件为在-20～-30℃下冷冻12～24h，所述解冻的条件为在4～25℃下解冻6～12h，所述循环冷冻和解冻的过程为2～7次。含有脂肪酶-无机杂化纳米花的聚合物溶液，在冷冻解冻过程中由于聚合物的氢键作用形成紧密的三维交联网络，使脂肪酶纳米花被成功包埋进具有较高强度的水凝胶中，保护纳米花的结构稳定性，从而保持其催化活性。在上述的技术方案中，在步骤(1)中，所述的无机金属离子溶液中无机金属离子的浓度为100～140mM。本专利技术所述的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的溶胀比为20～60。本专利技术还提供上述的含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶在降解葡萄酒中蛋白中的应用。葡萄酒的稳定性决定酒的品质，而葡萄酒中含有的不稳定蛋白质会在一定条件下产生聚集，使葡萄酒变得浑浊，这极大地影响了酒的品质，且传统处理葡萄酒中不稳定的蛋白的方法会将酒中稳定蛋白一起除去，这不但影响了酒的口感，而且也降低了酒的营养价值。本专利技术利用包埋于水凝胶中的蛋白酶-无机杂化纳米花催化降解葡萄酒中不稳定蛋白质，提高酒的品质和营养价值。本专利技术利用蛋白酶作为有机组分与无机金属离子通过自组装的方式合成蛋白酶-无机杂化纳米花，该材料具有纳米材料比表面积较大的性质，避免了酶与底物间的传质阻碍，从而使固定化后的蛋白酶较游离酶的酶活有一定提高。同时本专利技术将上述具有较高酶催化活性的纳米花包埋到生物相容性较好的含有至少两种亲水性聚合物的凝胶载体体系中，并通过反复冷冻-解冻的方法制备得到含有蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶材料，其独特的三维网状结构使酶稳定存在于催化体系中，从而达到二次固定化的目的并将其应用于实际的催化反应中。本专利技术的有益效果：本专利技术提供通过二次固定化的方法所合成的含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶型酶催化材料。与游离蛋白酶相比，蛋白酶纳米花因其较大的比表面积使酶的催化活性得以提高，通过二次固定化，使蛋白酶纳米花免受外界环境的影响，从而使酶的稳定性得到了改善，进一步提高了酶的重复利用性。该材料将蛋白酶-无机杂化纳米花和亲水性聚合物得到的水凝胶(如壳聚糖-PVA水凝胶)二者优异的性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含蛋白酶‑无机杂化纳米花的水凝胶，其包括：(a)蛋白酶和无机金属离子通过自组装而成的蛋白酶‑无机杂化纳米花；以及(b)含有至少两种亲水性聚合物的凝胶载体体系。

【技术特征摘要】
1.一种含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶，其包括：(a)蛋白酶和无机金属离子通过自组装而成的蛋白酶-无机杂化纳米花；以及(b)含有至少两种亲水性聚合物的凝胶载体体系。2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，其将所述的蛋白酶-无机杂化纳米花包埋到所述的凝胶载体体系中制备得到。3.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述的亲水性聚合物为壳聚糖、聚乙烯醇、海藻酸钠、海藻酸钙、或琼脂糖。4.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述的无机金属离子来源于氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶中的一种或几种。6.权利要求1～5的任一项所述的含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：(1)用水性溶液配制得到浓度为0.1～2mg/mL的蛋白酶溶液，加入无机金属离子溶液，在20～40℃下静置24～96小时，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到蛋白酶-无机杂化纳米花；(2)将至...

【专利技术属性】
技术研发人员：费旭，支慧，田晶，李尧，张海洋，赵丽媛，徐龙权，王一，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21