积雪草苷在治疗骨代谢异常中的应用制造技术

本发明专利技术公开了积雪草苷及其药学上可接受的衍生物在骨代谢异常中的作用。积雪草苷在骨代谢异常情况中，具备有同时抑制破骨细胞形成的调节的作用，作用剂量低，对于调节骨代谢异常有较好的效果。本发明专利技术明确积雪草苷相关药物的干预途径。阐明骨微环境中的分子机制和潜在的药理学干预途径对于鉴定新的治疗化合物至关重要。 1

The application of asiatiside in the treatment of abnormality of bone metabolism

The present invention discloses the role of asiaticoside and its pharmaceutically acceptable derivatives in bone metabolism abnormality. In abnormal bone metabolism, asiatiside has the function of regulating the formation of osteoclasts at the same time, and the dosage is low. It has a good effect on the regulation of bone metabolism abnormality. The invention discloses the intervening pathway of asiaticoside related drugs. Elucidate the molecular mechanisms of bone microenvironment and potential pharmacological intervention pathways for identifying new therapeutic compounds. One

【技术实现步骤摘要】
积雪草苷在治疗骨代谢异常中的应用
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及积雪草苷在治疗骨代谢异常中的应用。
技术介绍
骨代谢异常(Osteoporosis)是由成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收不平衡引起的一种动态病理状况。保持破骨细胞和成骨细胞之间的联系对于维持骨量至关重要。一旦破骨细胞诱导骨吸收超过成骨细胞诱导的骨形成，它将进展为骨质疏松症。骨质疏松的主要特征在于骨骼系统中的骨矿物质减少和结构紊乱。破骨细胞和成骨细胞的分化和形成受若干信号传导途径的调节。对于破骨细胞体系，NF-κB配体(RANKL)的受体激活剂是主要由软骨细胞和骨细胞表达的肿瘤坏死因子家族(TNF)的成员。RANKL对破骨细胞发生具有重要作用，并引发骨吸收的信号。RANKL表达促进形成破骨细胞生成，破骨细胞是衍生自骨髓巨噬细胞(BMM)和单核细胞谱系的一种多核TRAP阳性细胞。RANKL与其主要受体RANK/OPG结合，激发三个细胞内下游信号通路，即核因子-κB(NF-κB)，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，其中三个最终靶向激活的T-细胞(NFAT)。因此，针对性治疗RANKL激活的破骨细胞下游信号通路是抑制过量骨吸收的重要策略，该类治疗方法能够有效地减轻骨丢失。积雪草苷(Chrysosplenetin)为伞形科积雪草属植物积雪草的干燥全草，是积雪草提取物三萜皂甙的主要成分之一，现代药理研究证实积雪草苷具有抑制疤痕形成、促进创伤愈合、抗肿瘤、神经保护、抗焦虑、免疫调节等作用。但是目前尚没有关于积雪草苷在治疗骨代谢紊乱疾病中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开积雪草苷在治疗骨代谢异常中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：积雪草苷及其药学上可接受的衍生物在制备治疗、预防、缓解骨代谢异常中的应用。积雪草苷及其药学上可接受的衍生物在制备抑制RANKL诱导的破骨细胞发生药物中的应用。积雪草苷及其药学上可接受的衍生物在制备抑制破骨细胞功能药物中的应用。积雪草苷及其药学上可接受的衍生物在制备抑制RANKL激活的破骨细胞下游信号通路制剂中的应用。一种治疗骨代谢异常的制剂，制剂中含有积雪草苷或其药学上可接受的衍生物。本专利技术的有益效果是：积雪草苷在骨代谢异常情况中，具备有同时抑制破骨细胞形成的调节的作用，作用剂量低，对于调节骨代谢异常有较好的效果。本专利技术明确积雪草苷相关药物的干预途径。阐明骨微环境中的分子机制和潜在的药理学干预途径对于鉴定新的治疗化合物至关重要。附图说明图1中(A)积雪草苷的化学结构；(B)将BMM细胞与不同浓度的积雪草苷接种5天后TRAP对破骨细胞进行染色情况；(C)为TRAcP阳性多核细胞的数量；(D)用不同浓度的积雪草苷干预BMM48小时细胞存活。图2中(A)为TRAcP染色的破骨细胞；(B)积雪草苷干预TRAcP阳性破骨细胞数量；(C)积雪草苷干预破骨细胞数量与羟基磷灰石吸收面积的百分比。图3为积雪草苷抑制RANKL诱导的BMM中相关基因表达情况，其中(A)CathepsinK；(B)V-ATPased2；(C)NFATc1；(D)Acp5。图4是积雪草苷抑制RANKL诱导的Ca2+通路。(A)阴性组、RNAKL组和RNAKL+积雪草苷三组的钙通量60秒变化；(B)每组钙通量的平均强度变化。图5(A)积雪草苷干预下的NF-κB转染的RAW264.7细胞荧光素酶活性(B)积雪草苷预处理的破骨细胞提取蛋白裂解物的Westernblot检测图；(C)为IκB-α与时间关系的表达量；(D)为p-ERK1与时间关系的表达量；(E)为p-ERK2与时间关系的表达量。图6中(A)为不同浓度积雪草苷抑制NFAT活化的效果；(B)为积雪草苷预处理的破骨细胞提取蛋白裂解物的Westernblot检测；(C)为NFATc1与时间关系的蛋白表达量；(D)为c-fos与时间关系的蛋白表达量。具体实施方式实施例1眼草黄素抑制RANKL诱导的破骨细胞发生积雪草苷结构和特性如图1A所示。从C57BL/6小鼠的骨骼中分离出新鲜分离的骨髓巨噬细胞(BMM)进行破骨细胞培养，细胞在含有M-CSF的a-MEM中的股骨和胫骨骨髓腔中冲洗骨髓。将原始BMM以103个细胞/孔用a-MEM和M-CSF(25ng/mL)接种到96孔板中，并在37℃下保持5％、CO2过夜。每2天用BSAKL(50ng/mL)和不同浓度的积雪草苷(0.5、1、2.5、5、10、20μmol)刺激BMM直到形成破骨细胞。用4％多聚甲醛在磷酸盐缓冲盐水(PBS)在室温下固定10分钟，并用PBS洗涤4次。使用TRAcP阳性多核细胞数检测TRAcP活性。将具有三个或更多核的TRAcP阳性多核细胞作为破骨细胞样(OCL)细胞评分。结果表明，积雪草苷诱导的RANKL诱导的破骨细胞发生抑制的剂量依赖性方式。积雪草苷在高于5mol的剂量下显着减少破骨细胞形成(图1B，C)。进行细胞毒性测定(MTS)以检验积雪草苷的潜在细胞毒性。将BMM接种在96孔板中，在37℃下在5％、CO2中孵育过夜。然后将不同浓度的积雪草苷加入到BMM中，并将细胞在具有M-CSF(25ng/mL)的a-MEM培养基的化合物中培养48小时。然后向每个孔中加入20LMTS溶液2小时。使用BMG读板器在490mm波长下评价光密度(OD)。当积雪草苷浓度高至20μmol仍然对BMMs无细胞毒性作用(图1D)。2积雪草苷抑制RANKL诱导的破骨细胞功能使用羟基磷灰石吸收测定法测定破骨细胞活性。将BMM接种到6孔胶原包被的培养板上。细胞在37℃下粘附过夜，并加入50ng/mLRANKL和M-CSF刺激，直到破骨细胞开始形成4天。一旦观察到成熟的破骨细胞，用细胞解离溶液轻轻收获细胞，计数，并将等量的多核细胞铺板在羟基磷灰石涂覆的平板。在接种到羟基磷灰石板上之后，在50ng/mLGST-rRANKL和M-CSF存在下，用不同浓度(10和20μmol)的积雪草苷处理细胞。48小时后，一半孔获得TRAcP染色，以评估每孔用于破骨细胞计数的多核细胞数。剩余孔经漂白并干燥，并分析羟基磷灰石吸收区的百分比。结果表明，与阴性对照组相比，在积雪草苷10和20μmol干预时，破骨细胞吸收面积的百分比减弱。如图2A和B可观察到破骨细胞数量小，并呈现非剂量依赖性降低，但相对于吸收面积则较小程度。这些结果表明，积雪草苷对成熟破骨细胞存活影响小；它更倾向于抑制破骨细胞的骨吸收。3积雪草苷抑制RANKL诱导的基因表达PCR检测10、20μmol积雪草苷在破骨细胞发生过程中对RANKL诱导的基因表达水平的影响。结果与破骨细胞形成和活性测定一致，破骨细胞标记的基因CathepsinK、V-ATPased2、NFATc1、Acp5基因表达在培养第5天以剂量依赖性方式显着降低。(图3A-D)4积雪草苷抑制RANKL诱导的破骨细胞中的细胞内Ca2+通路为了研究积雪草苷对RANKL诱导的Ca2+通路的影响，在RANKL诱导的破骨细胞中检测细胞内Ca2+通路变化。RANKL治疗诱导Ca2+振荡，而在RANKL未治疗组中未观察到Ca2+通量。用积雪草苷处理过的细胞显着抑制RANKL诱导的Ca2+振荡(图4A-B)。这些结果表明积雪草苷抑制Ca2+信号通路。5积雪草苷抑制RANKL诱导的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.积雪草苷及其药学上可接受的衍生物在制备治疗、预防、缓解骨代谢异常制剂中的

【技术特征摘要】
1.积雪草苷及其药学上可接受的衍生物在制备治疗、预防、缓解骨代谢异常制剂中的应用。2.积雪草苷及其药学上可接受的衍生物在制备抑制RANKL诱导的破骨细胞发生药物中的应用。3.积雪草苷及其药学上可接受的衍生物在制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪郭驹，魏秋实，韩晓蕊，徐家科，何伟，陈镇秋，
申请(专利权)人：广州中医药大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：广东,44