一种泛生菌酰胺酶突变体、基因、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种泛生菌酰胺酶突变体、基因、工程菌及其应用，所述酰胺酶突变体是将SEQ ID No.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第105位、175位、301位、305位或309位进行单突变或多突变获得的。本发明专利技术提供的泛生菌酰胺酶突变体较亲本活力提高2～3倍，对底物2‑氯烟酰胺的耐受能力超过200mM，通过补料甚至超过1M，并且转化率仍能够保持在95％以上。利用本发明专利技术中所述的补料方法能够有效减轻2‑氯烟酸对酰胺酶或菌体的产物抑制效应，在保证较高催化效率的同时使得产物2‑氯烟酸尽可能地析出，方便产物的提取纯化。因此，本发明专利技术的酰胺酶突变体可以可用于酶法工业化生产2‑氯烟酸。

【技术实现步骤摘要】
一种泛生菌酰胺酶突变体、基因、工程菌及其应用(一)
本专利技术涉及一种2-氯烟酸的制备方法，特别涉及一种泛生菌酰胺酶突变体、编码基因，及其在水解2-氯烟酰胺制备农药、医药中间体2-氯烟酸中的应用。(二)
技术介绍
2-氯烟酸(2-ChloronicotinicAcid，简称2-CA)，又称2-氯-3-吡啶甲酸，属于烟酸的2位氯代化合物。2-氯烟酸是一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药和医药工业。在农药领域，2-氯烟酸可用于合成杀菌剂、杀虫剂和除草剂等，如烟嘧磺隆、吡氟草胺等(农药,2003,42,5-8；农药,2013,565-567)；在医药领域，可用于合成多种抗生素、心血管疾病治疗药物等，如抗艾滋病药物奈韦拉平，抗抑郁药物米氮平，非甾体消炎镇痛药尼氟灭酸、普拉洛芬以及烟甲灭酸等(化学与生物工程,2008,25,5-8；药学研究,2009,28,485-487；US5,569,760；精细化工中间体,2009,39,37-39)。2016年国内2-氯烟酸的需求量达3350吨(合成化学,2016,620-623)，市场需求巨大，应用前景广阔。目前，2-氯烟酸的工业生产主要采用化学法，可分为两大方法(合成化学,2011,19,285-286)：一是基于已有的吡啶环母体(CN101817781；CN104513198；CN103848783)，直接进行氯化或引入相应官能团；二是利用适当的活性直链化合物，通过接枝和闭环反应合成(CN102993092；CN103193705；CN104592104)。然而，以上两种化学法均存在工艺步骤冗长，条件苛刻，收率低，副产物多，环境负担重等问题。近年来，生物催化因其环境友好、选择性高、能耗低、催化剂可降解等优点，已迅速发展成为大宗及精细化学品制造的重要方法。因此，开发能够高效制备2-氯烟酸的生物催化剂具有重要意义。目前，有关生物法制备2-氯烟酸的研究较少，主要是利用酰胺酶水解2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸(CN101857889；NewBiotechnol.,2011,28,610-615；Catal.Commun.,2013,38,6-9；ProteinExpres.Purif.,2016,126,16-25；EnzymeMicrob.Technol.,2016,86,93-102)。酰胺酶(Amidase，EC3.5.1.x)是一类能够催化酰胺键断裂生成相应羧酸的水解酶，底物谱广，能高效催化各种脂肪族、芳香族以及杂环族酰胺水解。酰胺酶因其具有良好的化学和立体选择性，在医药、农药中间体制备方面中极具潜力，日益受到工业界重视。然而，已有的研究报道表明，酰胺酶水解2-氯烟酰胺的催化效率普遍较低。因此，提高酰胺酶催化2-氯烟酰胺的水解效率，以实现工业应用十分必要。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的是通过蛋白质定点饱和突变技术对泛生菌来源的酰胺酶(Pa-Ami)进行改造，提供一种突变体蛋白，提高其对2-氯烟酰胺的水解活力，从而有利于该酰胺酶在2-氯烟酸合成中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术通过对来源于Pantoeasp.(GenBankNo.WP008109374)的泛生菌酰胺酶基因进行克隆表达，利用全质粒PCR技术对包含泛生菌酰胺酶基因的表达载体进行定点饱和突变，构建突变文库。利用基于真实底物的96孔板高通量筛选模型进行筛选，获得一系列对2-氯烟酰胺活力明显提升的酰胺酶突变体，高效合成2-氯烟酸。最终本专利技术提供一种来源于泛生菌酰胺酶突变体，酰胺酶突变体是将SEQIDNo.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第105位、175位、301位、305位或309位进行单突变或多突变获得的。进一步，优选所述泛生菌酰胺酶突变体是将SEQIDNo.2所示氨基酸序列进行以下的点突变：(1)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸；(2)第301位的苏氨酸突变为亮氨酸；(3)第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(4)第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(5)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸的同时将第301位的苏氨酸突变为亮氨酸；(6)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸的同时将第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(7)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(8)第301位的苏氨酸突变为亮氨酸的同时将第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(9)第301位的苏氨酸突变为亮氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(10)第305位的丙氨酸突变为苏氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(11)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第301位的苏氨酸突变为亮氨酸的同时将第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(12)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第301位的苏氨酸突变为亮氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(13)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第305位的丙氨酸突变为苏氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(14)第301位的苏氨酸突变为亮氨酸并且第305位的丙氨酸突变为苏氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(15)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第301位的苏氨酸突变为亮氨酸并且第305位的丙氨酸突变为苏氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸。进一步，优选所述酰胺酶突变体是SEQIDNo.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第175位甘氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列为SEQIDNo.4，核苷酸序列为SEQIDNo.3。更进一步，优选所述酰胺酶突变体是SEQIDNo.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第175位甘氨酸突变为丙氨酸，同时将305位丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQIDNo.6，核苷酸序列为SEQIDNo.5。本专利技术还提供一种所述泛生菌酰胺酶突变体编码基因及编码基因构建的重组基因工程菌。本专利技术还涉及一种所述泛生菌酰胺酶突变体在催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸中的应用，具体所述的应用以含泛生菌酰胺酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-氯烟酰胺为底物，以pH为7.5～8.5(优选pH值为8.0)的缓冲液(优选Tris-HCl缓冲液)为反应介质构成反应体系，在30～60℃、150～500r/min条件下(优选40℃、200r/min)进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得2-氯烟酸。所述反应体系中，底物初始浓度为50～300mM(优选200mM)，所述催化剂的用量以湿菌体重量计，终浓度为1～10g/L反应体系(优选10g/L)。进一步，所述底物以补料形式加入，当反应体系中底物残留浓度低于上一次(即补料前的总加入量)加入量20％时(即每隔10～60min(优选15min))，补加终浓度50～200mM的底物(优选100mM)。本专利技术所述湿菌体按如下方法制备：将含泛生菌酰胺酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h，随后以体积浓度1％接种量转接到新鲜的含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min培养至菌体浓度OD600为0.4～0.8，再向培养基中加入终浓度为0.1～1mM的IPTG(优选0.1mM)，28℃、150r/min诱导培养12h，取培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种泛生菌酰胺酶突变体，其特征在于所述酰胺酶突变体是将SEQ ID No.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第105位、175位、301位、305位或309位进行单突变或多突变获得的。

【技术特征摘要】
1.一种泛生菌酰胺酶突变体，其特征在于所述酰胺酶突变体是将SEQIDNo.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第105位、175位、301位、305位或309位进行单突变或多突变获得的。2.如权利要求1所述泛生菌酰胺酶突变体，其特征在于所述酰胺酶突变体是SEQIDNo.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第175位甘氨酸突变为丙氨酸。3.如权利要求1所述泛生菌酰胺酶突变体，其特征在于所述酰胺酶突变体是SEQIDNo.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第175位甘氨酸突变为丙氨酸，同时将305位丙氨酸突变为苏氨酸。4.一种权利要求1所述泛生菌酰胺酶突变体编码基因。5.一种权利要求4所述泛生菌酰胺酶突变体编码基因构建的重组基因工程菌。6.一种权利要求1所述泛生菌酰胺酶突变体在催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用是以含泛生菌酰胺酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-氯烟酰胺为底物，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30～60℃、150～500r/min...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仁朝，郑裕国，金建强，吴哲明，汤晓玲，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33