一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过蛋白质工程改造嗜热古细菌(Archaeoglobus fulgidus)来源丙氨酸脱氢酶，使其最适酶活温度由82℃降至50℃，在大肠杆菌K12中删除L‑丙氨酸合成竞争路径上的关键基因，减少副产物生产，重组菌株中的编码L‑丙氨酸脱氢酶alaD基因和丙氨酸消旋酶dadX基因替换为改造后的嗜热古细菌来源的丙氨酸脱氢酶基因，利用该重组菌株进行在发酵罐中进行两阶段发酵，发酵42h，L‑丙氨酸产量达到153.9g/L，糖酸转化率81.0％。

【技术实现步骤摘要】
一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程

技术介绍
L-丙氨酸是最小的手性分子之一，是一种白色结晶或结晶性粉末，带有甜味，易溶于水，在食品、医药工业领域具有广泛的用途。在食品工业领域，L-丙氨酸作为天然甜味剂，不但可提高食品的营养价值，而且能够改善人工合成甜味剂的味感，使其如同天然甜味剂。在医药领域，L-丙氨酸常被用作氨基酸类营养补充剂，同时L-丙氨酸也是合成维生素B6、泛酸钙和其他有机化合物的重要原料化学品。L-丙氨酸生产的主要方法是利用固定化L-天冬氨酸-β-脱羧酶或者德阿昆哈假单胞菌的细胞菌悬液，以L-天冬氨酸为底物脱羧生产的。生产L-天冬氨酸的原料是富马酸，富马酸是经石油炼制生产的。随着石油资源的日渐短缺，原料受困于原油价格，且石油资源不可再生。利用可再生资源葡萄糖通过微生物发酵合成L-丙氨酸受到关注。通过系统代谢工程策略，删除L-丙氨酸合成的关键竞争途径、过量表达限速基因和染色体调控基因的启动子等，以及转运蛋白，可以在E.coli中实现了L-丙氨酸的高效生产。Smith等利用质粒在大肠杆菌ALS929中过量表达alaD，48h发酵能够生产88g/L的L-丙氨酸，但是重组菌培养需要添加抗生素和诱导剂，且L-丙氨酸生产强度不能达到工业生产水平。周丽等通过对大肠杆菌进行代谢工程改造，并将嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)丙氨酸脱氢酶基因(alaD)引入E.coli菌株，利用温度开关进行调节，在28～45℃两阶段发酵26h，产生106g/L高光学纯度的L-丙氨酸。嗜热古细菌(Archaeoglobusfulgidus)来源丙氨酸脱氢酶(AlaD)催化活力更高而且加稳定，D.T.Gallagher等已经解析出该酶的晶体结构，但是该酶在82℃下才能表现出最佳酶活。大肠杆菌适宜生长温度在25～45℃，温度过高或者过低都不利于菌体生长和目标产物的积累，但是该温度下嗜热古细菌丙氨酸脱氢酶酶活力显著降低，不利于L-丙氨酸的生产。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术通过蛋白质工程改造嗜热古细菌来源的AFAlaD酶，使其保持原本的高酶活力的同时最适温度降至50℃，再引入L-丙氨酸生产菌株，实现了L-丙氨酸更加高效的生产。本专利技术的第一个目的是提供一种丙氨酸脱氢酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的第二个目的是提供编码上述丙氨酸脱氢酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。本专利技术的第四个目的是提供表达所述丙氨酸脱氢酶突变体的重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是以E.coliK12为出发菌株，敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径中的关键基因：乙酸激酶基因ack-pta、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB、乙醇脱氢酶基因adhE、富马酸还原酶基因frdA、发酵型D-乳酸脱氢酶基因ldhA，得到E.coliΔ5(Δack-ptaΔpflBΔadhEΔfrdAΔldhA)，将核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的基因重组于E.coliΔ5，得到工程菌株E.coliΔ5D2。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组的方法具体为：1)将带有同源臂和kan基因的DNA片段1导入带有pKD46质粒的E.coliΔ5，进行同源重组替换E.coliK12的L-丙氨酸脱氢酶alaD基因，使用pCP20质粒消除kan抗性；得到中间菌E.coliΔ5D1；2)将带有同源臂和kan基因的DNA片段11导入带有pKD46质粒的E.coliΔ5，进行同源重组和替换E.coliΔ5D1的丙氨酸消旋酶dadX基因，使用pCP20质粒消除kan抗性；得到最终重组菌E.coliΔ5D2。在本专利技术的一种实施方式中，所述核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的基因来源于嗜热古细菌ATCC49558，经过密码子优化和基因突变得到。本专利技术的第五个目的是提供所述重组菌发酵生产L-丙氨酸的方法，所述方法是将摇瓶种子4～8％接种量接种于发酵培养基，空气量0.6～1.0vvm，温度28～32℃，搅拌250～350rpm培养6～8h，将通气量降低至0.01～0.1vvm，温度上升至40～45℃，继续搅拌40～80rpm，发酵过程当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，每升发酵液一次性补加90～110g葡萄糖，当葡萄糖消耗尽后立即结束发酵。本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：初始葡萄糖80～100g/L，玉米浆4～8g/L，(NH4)2SO42～4g/L，K2HPO4·12H2O8～12g/L，KH2PO44～8g/L，MgSO4·7H2O0.2～0.5g/L，柠檬酸铁铵0.1～0.3g/L。本专利技术的第六个目的是提供所述丙氨酸脱氢酶突变体在生产L-丙氨酸中的应用。本专利技术的有益之处：1.嗜热古细菌的AlaD酶在高温下才能充分发挥高酶活，利用已经报道的AlaD的晶体结构，同源建模后将该酶Loop结构上第41位赖氨酸K突变为组氨酸H，第65赖氨酸K突变为色氨酸W，改变其蛋白质的柔性，实现该酶在50℃下达到最高酶活。2.将改造后AFalaD**基因引入L-丙氨酸生产菌株，且该菌株发酵过程中不需要添加抗生素和诱导剂，通过两阶段控温分批补料发酵，该菌株利用廉价易得的葡萄糖实现L-丙氨酸的高效生产。附图说明图1所示为温度对AFalaD**酶活的影响。具体实施方式下述实施例中，都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得下述实施例中，以E.coliK12为出发菌株，也包括K12大肠杆菌衍生菌株或其他修饰后可以生产L-丙氨酸的大肠杆菌L-丙氨酸脱氢酶酶活检测：参照Ahaoroniwtz的方法，反应温度为30℃，每分钟氧化lμmolNADH的酶量为一个酶活力单位，使用NADH的摩尔消光系数(6.23xl03)计算其浓度，比活力以u/mg蛋白质表示。L-丙氨酸含量的测定：高效液相色谱法，以邻苯二甲醛(OPA)为衍生化试剂，色谱柱:ZORBAXSB-C18，流动相A为10mmol/LKH2PO4(8mol/LKOH调节pH5.3)，流动相B为乙腈：甲醇：A相＝5∶3∶1(冰醋酸调pH5.3)梯度洗脱，流速1mL/min，荧光检测器，检测波长330，460nm，柱温30℃。葡萄糖测定方法：使用SBA-40生物传感传感分析仪(山东省科学院生物研究所)进行分析。生产强度的计算：生产强度(g/L/h)＝L-丙氨酸产量(g/L)/发酵时间(h)。实施例1：嗜热古细菌丙氨酸脱氢酶基因的获取(1)将购买的嗜热古细菌接种于营养肉汤培养基，80℃培养10h后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA；(2)使用引物alaD1(5'ATGGAGACTCTTATTTTGACTCAGG3'，SEQIDNO.5)和alaD2(5'TCATATCCTGAAAAACTTTATTTTA3'，SEQIDNO.6)从基因组DNA中克隆得到编码丙氨酸脱氢酶的AFalaD基因；(3)将该基因连接至PMD19simple克隆载体测序，得到基因序列如SEQIDNO.1；(4)将SEQIDNO.1按照E.coli基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种丙氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。2.编码权利要求1所述的丙氨酸脱氢酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.含有权利要求2所述基因的表达载体。4.表达权利要求1所述的丙氨酸脱氢酶突变体的重组菌。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌。6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以E.coliK12为出发菌株，敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径中的关键基因：乙酸激酶基因ack-pta、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB、乙醇脱氢酶基因adhE、、富马酸还原酶基因frdA、发酵型D-乳酸脱氢酶基因ldhA，得到E.coliΔ5，将核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的基因重组于E.coliΔ5，得到工程菌株E.col...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐俊平，张帆，刘佳，刘立明，
申请(专利权)人：金华利家园生物工程有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33