人源化SIRPα‑IL15敲入小鼠及其使用方法技术

提供了从非人动物基因组表达人SIRPα和人IL‑15的经遗传修饰的非人动物。还提供了用于制备从非人动物基因组表达人SIRPα和人IL‑15的非人动物的方法，以及使用从非人动物基因组表达人SIRPα和人IL‑15的非人动物的方法。这些动物和方法在本领域中具有许多用途，包括例如对人T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞发育和功能进行建模，对人T细胞和/或NK细胞的人病原体感染进行建模，以及各种体内筛选。

Humanized SIRP alpha IL15 knock in mouse and method of use thereof

Provide the expression of human SIRP alpha and IL 15 genetically modified non-human animal from a non-human animal genome. There is also provided a method for preparing a non-human animal from a non-human animal genome expression of human SIRP alpha and IL 15, and the expression method of non-human animal human SIRP alpha and IL 15 from the use of non-human animal genome. These animals and methods have many uses in this field, including modeling of human T cell and / or natural killer (NK) cell development and function, modeling of human T cells and / or NK cells, and screening in vivo.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人源化SIRPα-IL15敲入小鼠及其使用方法交叉引用本申请要求2015年4月13日提交的美国临时申请号62/146,938；2015年4月16日提交的美国临时申请号62/148,667；和2016年1月27日提交的美国临时申请号62/287,842的权益，所述美国临时申请各自的公开内容以引用的方式整体并入本文。专利
本专利技术涉及经遗传修饰的非人动物的领域。引言经遗传修饰的非人动物诸如人源化小鼠持有用于转化研究的极大前景，因为它们允许在体内对人疾病进行建模和研究。在过去10年内，在通过在小鼠中遗传插入为人免疫细胞的适当发育和功能所必需的人基因来开发人源化小鼠方面已取得可观进展。然而，一些限制仍然使人源化小鼠在转化研究中的效用受限。特别是，人T细胞的发育和存活未达到最优。尽管已显示骨髓-肝-胸腺(BLT)模型会改进NS/NSG-BLT小鼠中的肠T细胞重建(DentonPW,NochiT,LimA等MucosalImmunol2012；5:555-566，NochiT,DentonPW,WahlA等CellRep2013；3:1874-1884)，但已显示那些小鼠会显现移植物抗宿主疾病，从而导致多个组织中的大量免疫细胞浸润(GreenblattMB,VrbanacV,TiveyT等PLoSOne2012；7:e44664)。因此，当前人源化小鼠模型仍然缺乏人T细胞的适当发育和功能。特别是，不存在人组织驻留记忆T细胞阻止人源化小鼠用作开发和测试更高效免疫策略的临床前工具，所述更高效免疫策略目的在于诱导针对诸如HIV的病原体的持久粘膜免疫。为更充分了解人组织驻留T细胞的发育和存活以及提供用以测试用于诱导持久T细胞依赖性粘膜免疫的新型免疫策略的模型，将适用的是具有产生人组织驻留T细胞的经遗传修饰的非人动物。这种小鼠模型也可用于研究人组织驻留免疫细胞与肠道微生物群的相互作用，例如微生物群可如何决定小肠和结肠中人免疫细胞的发育和存活。此外，本领域中对人自然杀伤(NK)细胞发育和功能的非人动物模型存在需要。概述提供了从非人动物基因组表达人SIRPα和人IL-15的经遗传修饰的非人动物。还提供了用于制备从非人动物基因组表达人SIRPα和人IL-15的非人动物的方法，以及使用从非人动物基因组表达人SIRPα和人IL-15的非人动物的方法。这些动物和方法在本领域中具有许多用途，包括例如对人T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞发育和功能进行建模；对人T细胞和/或NK细胞的人病原体感染进行建模；体内筛选抑制由激活、诱导和/或靶向T细胞和/或NK细胞的病原体引起的感染的药剂；体内筛选例如在健康或患病状态下调节人T细胞和/或NK细胞的发育和/或功能的药剂；体内筛选对人T细胞和/或NK细胞有毒的药剂；体内筛选防止、缓和或逆转毒性药剂对人T细胞和/或NK细胞的毒性作用的药剂；体内筛选候选T细胞诱导疫苗；以及体内和体外筛选通过激活NK细胞介导的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)过程来抑制肿瘤生长和/或感染的药剂。在第一方面，本公开提供一种经遗传修饰的非人动物，其包括：并入所述经遗传修饰的非人动物的基因组中的核酸序列，所述序列编码人SIRPα蛋白并且可操作地连接至SIRPα基因启动子；和并入所述经遗传修饰的非人动物的基因组中的核酸序列，所述序列编码人IL-15蛋白并且可操作地连接至IL-15基因启动子，其中所述经遗传修饰的非人动物表达所述人SIRPα蛋白和所述人IL-15蛋白。SIRPα基因启动子可为内源性非人SIRPα基因启动子。例如，SIRPα基因启动子可为在非人动物SIRPα基因座处的内源性非人SIRPα基因启动子。当SIRPα基因启动子是在非人动物SIRPα基因座处的内源性非人SIRPα基因启动子时，经遗传修饰的非人动物可包括在非人动物SIRPα基因座处非人SIRPα基因中的无效突变。在一个这样的实施方案中，经遗传修饰的非人动物是小鼠，并且无效突变是至少小鼠SIRPα外显子2-4的缺失。在另一个这样的实施方案中，经遗传修饰的非人动物就包括编码人SIRPα蛋白的核酸序列的等位基因而言是杂合的。在另一个这样的实施方案中，经遗传修饰的非人动物就包括编码人SIRPα蛋白的核酸序列的等位基因而言是纯合的。在所述第一方面的另一实施方案中，或在其任何以上实施方案的进一步实施方案中，编码人SIRPα蛋白的核酸序列包括人SIRPα基因组编码序列和非编码序列。在所述第一方面的另一实施方案中，或在其任何以上实施方案的进一步实施方案中，人SIRPα蛋白是全长人SIRPα蛋白的功能性片段。在一个这样的实施方案中，功能性片段包括人SIRPα的细胞外结构域，例如包括SEQIDNO:12的至少氨基酸28-362的细胞外结构域。在所述第一方面的另一实施方案中，或在其任何以上实施方案的进一步实施方案中，IL-15基因启动子是内源性非人IL-15基因启动子。在一个这样的实施方案中，IL-15基因启动子是在非人动物IL-15基因座处的内源性非人IL-15基因启动子。在一个实施方案中，当IL-15基因启动子是在非人动物IL-15基因座处的内源性非人IL-15基因启动子时，经遗传修饰的非人动物包括在非人动物IL-15基因座处非人IL-15基因中的无效突变。在一个这样的实施方案中，经遗传修饰的非人动物是小鼠，并且无效突变是至少小鼠IL-15外显子5-8的缺失。在另一个这样的实施方案中，经遗传修饰的非人动物就包括编码人IL-15蛋白的核酸序列的等位基因而言是杂合的。在另一个这样的实施方案中，经遗传修饰的非人动物就包括编码人IL-15蛋白的核酸序列的等位基因而言是纯合的。在所述第一方面的另一实施方案中，或在其任何以上实施方案的进一步实施方案中，编码人IL-15蛋白的核酸序列包括人IL-15基因组编码序列和非编码序列。在所述第一方面的另一实施方案中，或在其任何以上实施方案的进一步实施方案中，人IL-15蛋白是全长人IL-15蛋白的功能性片段。在所述第一方面的另一实施方案中，或在其任何以上实施方案的进一步实施方案中，经遗传修饰的非人动物是免疫缺陷的。例如，在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物包括Rag2基因敲除。在另一实施方案中，经遗传修饰的非人动物包括IL2rg基因敲除，或Rag2基因敲除和IL2rg基因敲除两者。在所述第一方面的另一实施方案中，或在其任何以上实施方案的进一步实施方案中，非人动物是哺乳动物。在一个这样的实施方案中，哺乳动物是啮齿动物，例如小鼠。在所述第一方面的另一实施方案中，或在其任何以上实施方案的进一步实施方案中，经遗传修饰的非人动物包括人造血细胞的植入物。在一个这样的实施方案中，经遗传修饰的非人动物包括被人病原体的感染。在一个实施方案中，当经遗传修饰的非人动物包括被人病原体的感染时，所述人病原体激活、诱导和/或靶向T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞。在另一实施方案中，当经遗传修饰的非人动物包括被人病原体的感染时，所述人病原体是影响(例如通过感染)人肠的病原体。在一个这样的实施方案中，人病原体是人轮状病毒。在另一实施方案中，当经遗传修饰的非人动物包括被人病原体的感染时，所述病原体影响(例如通过感染)人肺。在一个这样的实施方案中，人病原体是流感病毒。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经遗传修饰的非人动物，其包含：并入所述经遗传修饰的非人动物的基因组中的核酸序列，所述序列编码人SIRPα蛋白并且可操作地连接至SIRPα基因启动子；和并入所述经遗传修饰的非人动物的基因组中的核酸序列，所述序列编码人IL‑15蛋白并且可操作地连接至IL‑15基因启动子，其中所述经遗传修饰的非人动物表达所述人SIRPα蛋白和所述人IL‑15蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.13 US 62/146,938;2015.04.16 US 62/148,667;1.一种经遗传修饰的非人动物，其包含：并入所述经遗传修饰的非人动物的基因组中的核酸序列，所述序列编码人SIRPα蛋白并且可操作地连接至SIRPα基因启动子；和并入所述经遗传修饰的非人动物的基因组中的核酸序列，所述序列编码人IL-15蛋白并且可操作地连接至IL-15基因启动子，其中所述经遗传修饰的非人动物表达所述人SIRPα蛋白和所述人IL-15蛋白。2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述SIRPα基因启动子是内源性非人SIRPα基因启动子。3.根据权利要求2所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述SIRPα基因启动子是在所述非人动物SIRPα基因座处的内源性非人SIRPα基因启动子。4.根据权利要求3所述的经遗传修饰的非人动物，其包含在所述非人动物SIRPα基因座处非人SIRPα基因中的无效突变。5.根据权利要求4所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物是小鼠，并且所述无效突变是至少小鼠SIRPα外显子2-4的缺失。6.根据权利要求4所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物就包含编码所述人SIRPα蛋白的所述核酸序列的等位基因而言是杂合的。7.根据权利要求4所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物就包含编码所述人SIRPα蛋白的所述核酸序列的等位基因而言是纯合的。8.根据权利要求1-7中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述人SIRPα蛋白是全长人SIRPα蛋白的功能性片段。9.根据权利要求8所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述功能性片段包括人SIRPα的细胞外结构域。10.根据权利要求1-9中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述IL-15基因启动子是内源性非人IL-15基因启动子。11.根据权利要求10所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述IL-15基因启动子是在所述非人动物IL-15基因座处的内源性非人IL-15基因启动子。12.根据权利要求11所述的经遗传修饰的非人动物，其包含在所述非人动物IL-15基因座处非人IL-15基因中的无效突变。13.根据权利要求12所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物是小鼠，并且所述无效突变是至少小鼠IL-15外显子5-8的缺失。14.根据权利要求12所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物就包含编码所述人IL-15蛋白的所述核酸序列的等位基因而言是杂合的。15.根据权利要求12所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物就包含编码所述人IL-15蛋白的所述核酸序列的等位基因而言是纯合的。16.根据权利要求1-15中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中编码所述人IL-15蛋白的所述核酸序列包含人IL-15基因组编码序列和非编码序列。17.根据权利要求1-16中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述人IL-15蛋白是全长人IL-15蛋白的功能性片段。18.根据权利要求1-17中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物是免疫缺陷的。19.根据权利要求18所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物包含Rag2基因敲除。20.根据权利要求18或19所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物包含IL2rg基因敲除。21.根据权利要求1-20中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非人动物是哺乳动物。22.根据权利要求21所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述哺乳动物是啮齿动物。23.根据权利要求22所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述啮齿动物是小鼠。24.根据权利要求1-23中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物包含人造血细胞的植入物。25.根据权利要求24所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物包含被人病原体的感染。26.根据权利要求25所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述人病原体激活、诱导和/或靶向T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞。27.根据权利要求25所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述人病原体是感染人肠的病原体。28.根据权利要求27所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述人病原体是人轮状病毒。29.根据权利要求25所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述病原体感染人肺。30.根据权利要求29所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述人病原体是流感病毒。31.一种制备表达人IL-15蛋白和人SIRPα蛋白的非人动物的方法，其包括：向第一非人动物的基因组中引入编码人SIRPα蛋白的核酸序列，其中编码所述人SIRPα蛋白的所述序列可操作地连接至SIRPα基因启动子序列；向第二非人动物的基因组中引入编码人IL-15蛋白的核酸序列，其中编码所述人IL-15蛋白的所述序列可操作地连接至IL-15启动子序列；以及制备包含编码所述人IL-15蛋白的所述核酸序列和编码所述人SIRPα蛋白的所述核酸序列的第三非人动物，其中所述第三非人动物表达所述人IL-15蛋白和所述人SIPRα蛋白。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述引入步骤包括由包含编码人IL-15或人SIRPα的所述核酸的多能干细胞产生非人动物。33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述第一动物是与所述第二动物不同的动物，并且制备所述第三动物的所述步骤包括使所述第一动物和所述第二动物交配。34.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一动物和所述第二动物相同，向所述第一动物的基因组中进行引入的所述步骤包括使第一多能干细胞与编码所述人SIRPα蛋白的所述核酸序列接触以获得第二多能干细胞，向所述第二动物的基因组中进行引入的所述步骤包括使所述第二多能干细胞与编码所述人SIRPα蛋白的所述核酸序列接触以获得第三多能干细胞，并且所述第三非人动物由所述第三多能干细胞制备。35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。36.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞就Rag2而言是缺陷的。37.根据权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞就IL2rg而言是缺陷的。38.根据权利要求31-37中任一项所述的方法，其中所述第三非人动物就Rag2和IL2rg之一或两者而言是缺陷的。39.根据权利要求31-38中任一项所述的方法，其中所述IL-15启动子序列是人IL-15启动子序列。40.根据权利要求31-38中任一项所述的方法，其中所述IL-15启动子序列是内源性非人动物IL-15启动子序列。41.根据权利要求31-38中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·亨德勒布兰字提特，R·A·弗拉维尔，D·弗尔莱塔，C·格尔，M·G·曼茨，A·J·墨菲，N·W·帕姆，单亮，S·史蒂文斯，T·斯特罗维格，G·D·雅克波罗斯，M·德佐特，
申请(专利权)人：再生元制药公司，耶鲁大学，生物医学研究院，
类型：发明
国别省市：美国,US