3，7‑二羟基卓酚酮生物合成基因簇及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种3，7‑二羟基卓酚酮生物合成基因簇及其应用。该生物合成基因簇共包含8个结构基因：trlA、trlB、trlC、trlD、trlE、trlF、trlH以及trlI；1个调控相关基因：trlJ；以及1个其他功能基因：trlG。其中trlB、trlJ为参与强化分支酸代谢途径的关键调控蛋白，trlC、trlD、trlE提供能够在卓酚酮七元芳香环上进行顺序氧化的工具酶。本发明专利技术所提供的基因及其蛋白可用来发现或研究用于医药、工农业的新化合物、基因或蛋白。本发明专利技术还提供了一系列工程改造菌株能够高产不同的卓酚酮类化合物，如卓酚酮、7‑羟基卓酚酮、环庚三烯酮和1，4，6‑环庚三烯‑1‑羧酸。

【技术实现步骤摘要】
3，7-二羟基卓酚酮生物合成基因簇及其应用
本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及一种抗生素-3，7二羟基卓酚酮的生物合成基因簇及其应用。
技术介绍
3，7二羟基卓酚酮是一类具有稀有七元芳香环结构的天然产物，最初于1988年在StreptomycestropolofaciensNo.K611-97(ATCC53548)中发现并报道。3，7二羟基卓酚酮具有非常好的抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、分枝杆菌及真菌等广谱抗菌活性，同时还具有非常好的抗肿瘤尤其是B16黑色素瘤的活性以及抗病毒如艾滋病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)及疱疹病毒(HSV)等活性。3，7二羟基卓酚酮因其特殊的α-羟基酮的结构，可以螯合金属离子，因而其可以发挥金属离子螯合剂的功能，抑制金属酶的活性。基于卓酚酮类化合物的稀有结构骨架与优异的生物活性，卓酚酮类化合物已经成为了一个非常重要的药物研发的先导化合物(leadcompound)，近期对于卓酚酮类化合物尤其是β-thujaplicin的结构改造的工作也取得了很大进展。然而3，7-二羟基卓酚酮由于产量的限制，导致其在发现后的近30年中取得的研究进展十分有限。相对于真菌以及植物中研究的比较透彻的卓酚酮类化合物的生物合成途径，细菌中的卓酚酮类化合物的生物合成途径还没有得到很好的揭示。尤其是3，7-二羟基卓酚酮七元芳香环上的羟基化修饰目前为止还没有报道，然而3，7-二羟基卓酚酮上的羟基化修饰是其螯合金属离子发挥抗菌、抗癌以及抗病毒作用所必需的。因而3，7-二羟基卓酚酮生物合成途径的揭示，对于理解细菌卓酚酮类化合物的合成机理，并进一步利用其进行结构改造具有重要意义。在本专利技术中，通过高通量异源表达筛选的方法，获得了3，7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇。结合后续的DNA测序以及分子生物学与生物化学等技术手段，阐明了3，7-二羟基卓酚酮的生物合成机制，尤其是3，7-二羟基卓酚酮七元芳香环上羟基化修饰。基于此研究，本专利技术可以利用3，7-二羟基卓酚酮生物合成基因簇中的羟基化酶对其他卓酚酮结构类似物进行修饰，提高相应化合物的生物活性；亦或是在羟基化修饰的基础上进一步的结合化学衍生修饰等手段合成更多活性优良的化合物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种3，7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇及其所包含的蛋白的功能的研究应用。具体地，本专利技术提供了由基因工程菌株StreptomycescoelicolorM1154/pCXF1CGMCCNo.13916产生的具有广谱抗菌、抗癌以及抗病毒活性的抗生素-3，7-二羟基卓酚酮(3，7-dihydroxytropolone)的生物合成基因簇的克隆、异源表达、测序分析、生物合成途径研究、相关酶的功能研究及其应用。所述天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1154/pCXF1已于2017年3月23日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.13916。中断3，7-二羟基卓酚酮生物合成基因簇的天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1154/pCXF3已于2017年4月7日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.14005。中断单加氧酶合成基因trlC的天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1154/pCXF6已于2017年3月23日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.13918。中断黄素还原酶合成基因trlD的天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1154/pCXF7已于2017年3月23日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.13919。中断单加氧酶合成基因trlE的天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1154/pCXF8已于2017年3月23日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.13920。中断氧化酶合成基因trlF的天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M1154/pCXF9已于2017年3月23日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCNo.13921。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一种3，7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇，所述基因簇包括编码3，7-二羟基卓酚酮生物合成所涉及的10个基因：S1、负责3，7-二羟基卓酚酮生物合成的结构基因，包括trlA、trlB、trlC、trlD、trlE、trlF、trlH以及trlI；其中，trlA位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第1-480位，编码酰基辅酶A脱水酶，大小为159个氨基酸；trlB位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第530-1984位，编码3-脱氧-D-阿糖基庚酮酸-7-磷酸合成酶，大小为484个氨基酸；trlC位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第2248-3840位，编码单加氧酶，大小为530个氨基酸；trlD位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第3837-4394位，编码黄素还原酶，大小为185个氨基酸；trlE位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第4439-5641位，编码单加氧酶，大小为400个氨基酸；trlF位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第5697-6308位，编码氧化酶，大小为203个氨基酸；trlH位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第6536-7297位，编码硫酯酶，大小为253个氨基酸；trlI位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第7299-8508位，编码预苯酸脱水酶-分支酸变位酶双功能酶，大小为402个氨基酸；S2、负责3，7-二羟基卓酚酮生物合成的调控基因，包括trlJ；trlJ位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第8483-9112位，编码TetR家族转录调控蛋白，大小为209个氨基酸；S3、其他功能蛋白基因，包括trlG；trlG位于如SEQIDNO.1所示基因簇核苷酸序列的第6327-6539位，编码其他功能蛋白，大小为70个氨基酸。优选的，所述基因簇的碱基序列如SEQIDNO.1中第1-9112位所示。第二方面，本专利技术还涉及一种上述3，7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇在催化合成3，7-二羟基卓酚酮及其类似物中的用途。第三方面，本专利技术还涉及一种上述3，7-二羟基卓酚酮生物合成基因簇编码的蛋白。优选的，编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2-11所示。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种3，7‑二羟基卓酚酮的生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括编码3，7‑二羟基卓酚酮生物合成所涉及的10个基因：S1、负责3，7‑二羟基卓酚酮生物合成的结构基因，包括trlA、trlB、trlC、trlD、trlE、trlF、trlH以及trlI；其中，trlA位于如SEQ ID NO.1所示序列的第1‑480位，编码酰基辅酶A脱水酶，大小为159个氨基酸；trlB位于如SEQ ID NO.1所示序列的第530‑1984位，编码3‑脱氧‑D‑阿糖基庚酮酸‑7‑磷酸合成酶，大小为484个氨基酸；trlC位于如SEQ ID NO.1所示序列的第2248‑3840位，编码单加氧酶，大小为530个氨基酸；trlD位于如SEQ ID NO.1所示序列的第3837‑4394位，编码黄素还原酶，大小为185个氨基酸；trlE位于如SEQ ID NO.1所示序列的第4439‑5641位，编码单加氧酶，大小为400个氨基酸；trlF位于如SEQ ID NO.1所示序列的第5697‑6308位，编码氧化酶，大小为203个氨基酸；trlH位于如SEQ ID NO.1所示序列的第6536‑7297位，编码硫酯酶，大小为253个氨基酸；trlI位于如SEQ ID NO.1所示序列的第7299‑8508位，编码预苯酸脱水酶‑分支酸变位酶双功能酶，大小为402个氨基酸；S2、负责3，7‑二羟基卓酚酮生物合成的调控基因，包括trlJ；trlJ位于如SEQ ID NO.1所示序列的第8483‑9112位，编码TetR家族转录调控蛋白，大小为209个氨基酸；S3、其他功能蛋白基因，包括trlG；trlG位于如SEQ ID NO.1所示序列的第6327‑6539位，编码其他功能蛋白，大小为70个氨基酸。...

【技术特征摘要】
1.一种3，7-二羟基卓酚酮的生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括编码3，7-二羟基卓酚酮生物合成所涉及的10个基因：S1、负责3，7-二羟基卓酚酮生物合成的结构基因，包括trlA、trlB、trlC、trlD、trlE、trlF、trlH以及trlI；其中，trlA位于如SEQIDNO.1所示序列的第1-480位，编码酰基辅酶A脱水酶，大小为159个氨基酸；trlB位于如SEQIDNO.1所示序列的第530-1984位，编码3-脱氧-D-阿糖基庚酮酸-7-磷酸合成酶，大小为484个氨基酸；trlC位于如SEQIDNO.1所示序列的第2248-3840位，编码单加氧酶，大小为530个氨基酸；trlD位于如SEQIDNO.1所示序列的第3837-4394位，编码黄素还原酶，大小为185个氨基酸；trlE位于如SEQIDNO.1所示序列的第4439-5641位，编码单加氧酶，大小为400个氨基酸；trlF位于如SEQIDNO.1所示序列的第5697-6308位，编码氧化酶，大小为203个氨基酸；trlH位于如SEQIDNO.1所示序列的第6536-7297位，编码硫酯酶，大小为253个氨基酸；trlI位于如SEQIDNO.1所示序列的第7299-8508位，编码预苯酸脱水酶-分支酸变位酶双功能酶，大小为402个氨基酸；S2、负责3，7-二羟基卓酚酮生物合成的调控基因，包括trlJ；trlJ位于如SEQIDNO.1所示序列的第8483-9112位，编码TetR家族转录调控...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶美凤，陈雪斐，徐敏，王业民，邓子新，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31