一种百合萜类花香基因LoTPS3及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种百合萜类花香基因

A Lilium terpenoid flower gene LoTPS3 and its application

The present invention discloses a liliteroid flower fragrance gene

【技术实现步骤摘要】
一种百合萜类花香基因LoTPS3及其应用
本专利技术涉及基因工程
，更具体地，涉及一种百合萜类花香基因LoTPS3及其应用。
技术介绍
花香在植物繁殖过程中发挥了重要的作用，不仅可以提高作物的产量和质量，还可以增加观赏植物和切花的审美特性。大多数植物的花香是由一系列低分子量的挥发物混合在一起形成，其化学成分主要是萜烯类化合物、苯丙酸类化合物/苯环型化合物和脂肪酸衍生物（Picherskyetal.,2006；Dudarevaetal.,2004），而萜烯类化合物种类繁多，是植物次生代谢中种类最多的一类(PicherskyandDudareva,2007)。萜类化合物是一类由数个异戊二烯(isoprene,C5)结构单位构成的化合物的统称，根据其数目不同可分为单萜(monoterpene,C10)、倍半萜(sesquiterpene,C15)和二萜(diterpene,C20)等。萜类不仅是组成花香的主要成分，还有其它众多的生理生态作用。如，吸引授粉者；调节植物的生长和发育；调节植物耐热性；抵御光氧化胁迫；直接和间接的植物防御。除此之外，萜类还广泛应用于香料、化妆品、食物、药物和杀虫剂等行业，有非常大的商业价值(Tholl,2006;YuandUtsumi,2009)。萜类化合物如沉香醇，罗勒烯等是组成‘西伯利亚’百合花香的主要成分之一，且释放具有昼夜节律性（范燕萍，2008）。萜类合成酶(terpenesynthase,TPS)是萜类合成的关键酶，按形成产物的不同，可分为单萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶等。萜类合成酶以异戊二烯焦磷酸（GPP，FPP和GGPP）为底物合成大量结构、功能多样的萜类化合物，由于大多数萜类化合物为环状，因此萜类合成酶也被称为环化酶(Liangetal.,2002)。萜类合成酶以金属离子为辅因子，使异戊二烯焦磷酸发生亲电反应，首先，底物通过焦磷酸基团断裂或质子化的离子化过程，形成与酶结合的异戊二烯碳正离子中间体，由于酶活性位点的限制，碳正离子发生电子重排，然后经过一系列的异构化、环化或重排，最后经过去离子化或加水形成环状或非环状的萜类化合物(Degenhardtetal.,2009;ZulakandBohlmann,2010)。萜类合成酶蛋白一般是由550～850个氨基酸残基组成，相对分子质量为50～100kDa(Bohlmannetal.,1998)。研究表明，萜类合成酶在三维结构上有很高的相似性，由α-螺旋、短的连接环和拐角等立体结构组成，并含有两个明显的结构区域，即C-末端结构区域和N-末端结构区域。酶的活性中心是C-末端的一个疏水区域，由6个α-螺旋组成，这个疏水区域利于底物疏水烃基部分进入和结合。N-末端没有特殊的功能元件，突变分析显示，这个区域起到方便C-末端催化活性区域正确折叠的脚手架作用(Degenhardtetal.,2009;Starksetal.,1997)。几乎所有的萜类合成酶都含有一个天冬氨酸富集基序（DDxxD），这个基序被认为起到结合金属离子的作用(SacchettiniandPoulter,1997)，它定位在活性位点的入口处，在引导底物催化时发挥重要的作用，若基序发生突变则会导致酶催化活性的下降或产生异常的产物。根据萜类合成酶氨基酸序列的相关性，将TPS家族分为七个亚家族，从TPSa—TPSg，同一亚家族的不同成员之间有最小40%的同源性(Bohlmannetal.,1998;Dudarevaetal.,2003)。萜类合成酶是萜类化合物生物合成的关键酶，因此也成了萜类生物合成过程中研究最多和最深入的酶类，自1992年在烟草中克隆了两个倍半萜合成酶基因(FacchiniandChappell,1992)以来，科学家已在40多种植物中克隆了200多个单萜和倍半萜合成酶基因(Degenhardtetal.,2009)，涉及农作物(Chenetal.,1995;Kollneretal.,2008;Yuanetal.,2008)、针叶类植物(Bohlmannetal.,1999;Martinetal.,2004)、药用植物(Deguerryetal.,2006)、香料植物和观赏植物以及拟南芥(Chenetal.,2003)等模式植物。Dudareva等(1996)在仙女扇中克隆了一个花器官特异表达并受植物发育调控的单萜合成酶基因-沉香醇合成酶基因，这是第一次克隆到特异表达的花香合成酶基因。在拟南芥基因组中也发现了三个在花中特异表达的萜类合成酶基因，并且这三个酶催化产生了拟南芥花中主要的挥发性物质(Chenetal.,2003)。挥发性萜类物质经常在特定的时期或发育阶段，从特定的植物组织中释放出来，用来吸引授粉昆虫。在金鱼草中(Dudarevaetal.,2003)，两个主要的香气成分（月桂烯和罗勒烯）在花的上唇瓣和下唇瓣部位释放，并且受发育和昼夜节律的调控，这种昼夜节律可能与相应萜类合成酶基因在一天中的表达量不同有关。在烟草花瓣和柱头中的许多萜类物质在夜间释放，主要由于1,8-桉油醇合成酶基因在转录时受昼夜节律的调控(Roederetal.,2007)。在矮牵牛，猕猴桃等花香释放具有昼夜节律的植物中，相关的萜类合成酶基因的表达也具有明显的昼夜节律(Nieuwenhuizenetal.,2009;Kongetal.,2012)。许多植物萜类花香物质释放都遵循昼夜节律，萜类释放的这种特异改变可能与授粉昆虫的出现时间有关系。例如，由夜间活动昆虫授粉的花卉可能在傍晚时候香气释放量达到最大，使其与夜间活动昆虫的最大传粉时期相一致(YuandUtsumi,2009)，这都是植物为适应外界环境而逐渐进化来的。近年来，植物萜类生物合成的基因操作已成为一个热门的研究领域。Lucker等(2004b)通过基因工程手段将三个不同的柠檬单萜合成酶转入到萜类挥发量很少的烟草中，结果在转基因烟草的叶和花中，单萜混合物（(+)-柠檬烯、γ-萜品烯，β-蒎烯）的含量得到了明显的提高，组分得到了改变，并且人类的嗅觉可以感知到转基因烟草释放的单萜挥发性物质。这为采用基因工程技术培育香花品种提供了一条有效的途径。
技术实现思路
目前，国内对萜类的研究主要集中在药用、香料提取等方面，而对百合萜类花香基因却鲜有报道。克隆花香基因是对百合花香形成机理研究的前提，揭示百合花香和诱导防御反应的分子机理可以增加花香和增强其抗性。这为采用基因工程的方法培育具浓郁花香植物新品种提供了一条崭新的途径。本专利技术的目的是分离克隆‘西伯利亚’百合中携带的一个控制萜类花香成分罗勒烯和橙花叔醇的双功能酶基因LoTPS3。本专利技术另一目的在于提供上述LoTPS3基因编码的蛋白质。本专利技术另一目的在于提供含有上述基因的表达载体。本专利技术还有一个目的在于提供上述基因在产生分子标记及其在选育对花香品种中的应用，以及上述基因编码的蛋白质在制备香精和药物中的应用。本专利技术通过以下技术方案予以实现上述目的：一种百合萜类花香基因LoTPS3，所述基因的全长cDNA序列如SEQIDNO:1所示，所述基因可赋予百合花朵沉香醇香味。本专利技术所示百合萜类花香基因LoTPS3仅在有香味的百合花组织表达，在无香味的百合品种中不表达，并且其表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种百合萜类花香基因

【技术特征摘要】
1.一种百合萜类花香基因LoTPS3，其特征在于，所述基因的全长cDNA序列如SEQIDNO:1所示，基因编码序列如SEQIDNO:2所示。2.一种由权利要求1所述百合萜类花香基因LoTPS3编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。3.一种用于扩增权利要求1所述百合萜类花香基因LoTPS3的引物对，其特征在于，所述引物对序列如SEQIDNO:4～5或SEQIDNO:10～11所示。4.一种用于检测权利要求1所述百合萜类花香基因LoTPS3的荧光定量引物对，其特征在于，所述引物对序列如SEQIDNO:6～7所示。5.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：范燕萍，法海，柯艳果，余让才，岳跃冲，李昕悦，玉云祎，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44