一个人类锌指蛋白家族新基因ZNF325制造技术

一个人类锌指蛋白家族新基因ＺＮＦ３２５，涉及一种人类基因，它的ｃＤＮＡ全长２６９７ｂｐ，位于染色体７ｐ２２，编码的蛋白质全长４６２个氨基酸，含１５个Ｃ＃－［２］Ｈ＃－［２］型的锌指；ＺＮＦ３２５在成人和胚胎时期广泛表达，说明该基因对人类早期胚胎正常发育和对人体各组织的正常功能起重要作用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种人类基因，具体是锌指蛋白家族的一个人类新基因ZNF325的cDNA全长克隆，及其它在成人各器官中的表达和在不同发育阶段人类胚胎各器官中的表达。
技术介绍
锌指蛋白家族是一个巨大的超基因家族，它们广泛的存在于各种物种中，包括酵母，果蝇，爪蟾，鼠和人。锌指蛋白家族一般具有该家族的特征性结构-----锌指蛋白结构域，是最先在果蝇中被确立的、为中枢神经系统和肌肉等组织分化所必需的调控因子(Postigo et al.1997)。锌指蛋白基因zfh-1在早期果蝇胚胎的中胚层以及晚期胚胎的多种中胚层衍生结构中表达，参与调节表达eve基因的心脏前体细胞(EPC)的形成；还与tinman基因一同调节包括性腺中胚层在内的外侧中胚层的进一步分化(Lai Z C.，et al，1999)。zfh-1在脊椎动物中的同源基因也有相似的功能。如锌指蛋白基因ZEB的表达产物ZEB-1和ZEB-2蛋白，在肌肉、中枢神经系统、T淋巴细胞等组织中均有表达，而最近发现ZEB蛋白包含两个独立的区域，分别调节哺乳动物肌细胞和淋巴细胞的分化(Postigo et al.1997)。锌指蛋白基因家族也是人类最大的基因家族之一，很多目前已知的人类转录调控因子都是锌指蛋白成员(Gou et al.，2001)。典型的锌指蛋白为C2H2型，即Zn++离子与两个半胱氨基酸残基和两个组氨酸残基形成配位键。除了这四个氨基酸残基外，还有两个芳香族氨基酸残基和一个亮氨酸残基也高度保守。配位结构加上Phe和Leu所形成的疏水核心，确定了锌指的基本结构和形状。锌指的三维结构包含两个短的β-折叠和一个α-螺旋。研究表明锌指结构对于维持DNA结构域的结构是必需的，在很多情况下它还与DNA直接相互作用(Coppin et al.，2002)。人们认为这种锌指结构在蛋白质结合到核苷酸上时起作用，在细胞的分化和繁殖过程中，它可以激活或者抑制基因的表达，如锌指蛋白ZEB-1，snail，hFOG等，而且，这种锌指结构可以识别相同的DNA序列，如ZEB-1和snail的锌指结构可以识别它们各自靶位点的E-BOX和E-BOX类似序列(Burke et al，.2002)。研究表明锌指蛋白基因在生物发育过程中充当持家基因或调节因子的角色，也有很多锌指蛋白在人类早期胚胎发育过程中起着重要的作用。如ZNF174是某些生长因子基因的负调节子(Williams et al.，1995)；AJ18参与骨的发育(Jheon et al.，2001)；Hsal1，WT1，以及TR-alpha-1等锌指蛋白与心脏功能和疾病有关，HFHZ可能对心脏肥大的病理起重要作用(Dai and Liew，1998)。锌指蛋白GATA4和hFOG2参与心脏的形成和疾病的发生(Crispino et al.，2001)。许多锌指蛋白参与某些肿瘤的形成，如WT1(Dennis et al.，2002)和RB基因(Lee，et al.，1987)。同时，在模型动物果蝇中，锌指蛋白Zfh1参与调节eve基因的表达，控制心脏前体细胞(EPC)的形成，对果蝇心脏的特异分化是必需的(Su et al.，1999)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个人类锌指蛋白家族新基因ZNF325的全长cDNA序列，分析它在成人各器官及人类胚胎不同发育阶段中的表达，以探索该基因在人类胚胎发育过程中和成体发育中所起的作用。本专利技术以本实验室提取的脑部mRNA反转录所得的cDNA文库为模板，根据C2H2型锌指结构及相邻锌指间的保守序列区域设计兼并引物A1和A2，进行PCR扩增，所得PCR扩增产物经琼脂糖凝胶点泳分离，与pUCm-T(SANGONG)载体相连接后转化进入大肠杆菌DH5α，转化后进一步测序分析。把所得的序列用Blastn去搜索dbEST发现是EST AU125576的部分序列，把ESTAU125576用blastn EST去搜索Genbank，我们发现了一个包括EST AU125576的EST群，它们由ESTs BG957653，BE568216，AV708178，AU125576 andAU131235组成，这个EST群属于一个新基因。以胚胎脑文库为模板，分别用四对引物5’-RACE anti-sense-outer/UPM，5’-RACEanti-sense-inner/UPM；3’-RACE sense-outer/NUP，3’-RACEsense-inner/NUP进行5｀-RACE和3｀-RACE快速扩增末端，其中5’-RACEanti-sense-outer，5’-RACE anti-sense-inner；3’-RACE sense-outer，3’-RACE sense-inner是基因特异引物，UPM和NUP由SMART RACE试剂盒提供，RACE反应分别得到了930bp和318bp的目的片段，经T-载体克隆、测序，它们为该基因的5｀端和3｀端，将它们拼接为全长cDNA，共2697bp，至此，我们得到了新基因的全长cDNA，经国际人类基因命名委员会批准命名为ZNF325。ZNF325此基因位于染色体7p22，长2697个碱基，含5个外显子，在基因组DNA上长15kb。其开放阅读框前5’端上游含924bp的非编码区，从925bp到2313bp为开放阅读框，2313bp后为3’端非编码序列。它编码的蛋白质全长462个氨基酸，含15个C2H2型的锌指，它是一种典型的锌指结构域，由#-X-C-X(1-5)-C-X3-#-X5-#-X2-H-X(3-6)-组成，其中X代表任何一种氨基酸，最后一个氨基酸是组氨酸或半胱氨酸，#代表对锌指结构起重要稳定折叠作用的氨基酸位置。ZNF325的基因序列已递交到GenBank，受理号为AF505656。用JELLYFISH程序的ALIGNMENT分析其与锌指蛋白家族的其它锌指蛋白的同源发现，ZNF325与RBAK同源度高达71％(见图1)。RBAK是人们发现的第一个与RB相互作用的转录抑制因子(Skkapek et al.，2000)。而RB是一个能抑制E2F转录因子家族成员激活的基因表达的抑癌基因。Northern Bolt分析表明该基因在成人的各个组织中普遍表达。进行8种正常人体组织mRNA的Northern杂交分析，结果为2.7kb的ZNF325 mRNA在成人的各个组织中普遍表达(见图2A)，此结果表明ZNF325在成体中的表达不具有细胞特异性，它可能对人体各个组织的正常功能都起重要作用。进行16周，18周，20.5周，22周，23周和24周的人体胚胎各种组织总RNA膜的Northern杂交分析，结果表明该基因在人体不同发育时期的胚胎的表达情况与在成体的表达情况相似，ZNF325 mRNA在胚胎时期广泛表达(见图2B-2G)，说明ZNF325可能对人类早期胚胎的正常发育起了重要作用。它的结构和表达特征预示着它编码的是一个具DNA结合功能的转录调控因子。本专利技术的优点1.提供了一个人类新基因ZNF325基因的全长cDNA序列，并描述了其编码的蛋白产物与重要基因RBAK的同源性，证明了该基因是C2H2型锌指蛋白基因家族的成员之一。2.该基因编码的蛋白产物为锌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个人类锌指蛋白家族新基因ＺＮＦ３２５，其特征在于该基因的ｃＤＮＡ核苷酸序列和编码氨基酸序列如下：ａｃｃａｇｇｔｃｔｇ ｇｔｃｔａｃａｇｔｃ ｇａｃｔａａｇｔｃｇ ｇｔｃｇｇｃｃｃｇｇ ｇｃｃｃｃｔｃｔｇｇ ａｇｃａｎａａｎｇｇ ６０ ｃｃｔｔｇｇｔｇａｇ ｇｃｇｇａｃａｇｇａ ａｇｇｇａｃｃｔｃｇ ｃｇａｇｃａｇａｃｇ ｃｇｃｇｃｃｃｇｃｇ ａｃａｇｃａａｔｃｃ １２０ｃｇｃｃｃｃｇｇｃｃ ｔｇｔｃｇｇｇａｇｃ ｇｇｔｇｇｇｇｃａｇ ａｇｇｃｔｇｃｇｇａ ｇｃｃｃ ｃａｇｇａｇ ｇａｔｃｔｇｃｃｔｃ １８０ｃｇｃｔｔｔｃａｃａ ｇｔｃｃｔｃｃａｇａ ｔｔｔｔｔｃｃａａｇ ａｇｃａｇｃａｇａａ ａａｔｇａａｔａａａ ｔｃｃｃｔｇｇｇｇｃ ２４０ｃａｇｔｇｔｃａｔｔ ｃａａｇｇａｃｇｔｇ ｇｃｔｇ ｔｇｇａｃｔ ｔｃａｃｃｃａｇｇａ ｇｇａａｔｇｇｃａｇ ｃａｇｃｔｇｇａｔｃ ３００ｃｔｇａｇｃａｇａａ ｇａｔａａｃｔｔａｃ ａｇｇｇａｔｇｔｇａ ｔｇｃｔｇｇａｇａａ ｃｔａｃａｇｃａａｔ ｃｔａｇｔｔｔｃｔｇ ３６０ｔｇｇｇ ｇｔａｔｃａ ｃａｔｔａｔｃａａａ ｃｃｇｇａｔｇｔｔａ ｔｃａｇｃａａｇｔｔ ｇｇａｇｃａａｇｇａ ｇａａｇａｇｃｃａｔ ４２０ｇｇａｔａｇｔａｇａ ａｇｇａｇａａｔｔｃ ｃｔａｃｔｔｃａｇａ ｇｃｔａｔｃｃａｇａ ｔｇａａｇｔｃｔｇ ｇ ｃａａａｃｔｇａｔｇ ４８０ａｃｃｔａａｔａｇａ ｇａｇａａｔｃｃａｇ ｇａａｇａｇｇａａａ ａｔａａａｃｃｔｔｃ ａａｇｇｃａａａｃｔ ｇｔｇｔｔｃａｔｔｇ ５４０ａｇａｃｃｃｔｇａｔ ｔｇａａｇａｇａｇａ ｇｇｔａａｔｇｔｔ ｃ ｃｔｇｇｔａａａａｃ ｔｔｔｔｇａｔｇｔａ ｇａａａｃｇａａｃｃ ６００ｃｔｇｔｔｃｃｔｔｃ ａａｇａａａａａｔａ ｇｃｃｔａｔａａａａ ａｔａｇｃｃｔｃｔｇ ｔｇａｃｔｃａｔｇｔ ｇａａａａｇｔｇｔｔ ６６０ｔａａｃｇｔｃｔｇ ｔ ｔｔｃａｇａａｔａｔ ａｔｔａｇｔａｇｔｇ ａｔｇｇａａｇｃｔａ ｔｇｃａａｇａａｔｇ ａａａｇｃｔｇａｔｇ ７２０ａａｔｇｔａｇｔｇｇ ａｔｔｇｔｇｇｇａａ ａｔｃａｃｔｃｃｔｃ ｃａｔａｔｔａａｇｃ ｔｔｇａｇａａａａｃ ｔｃａ ｔｃｃａｇｇａ ７８０ｇａｔｃｎａｇｃｔｔ ａｔｇａｔｔｔａａｔ ｃａａａａｔｇｇｇｇ ａａｃｃｔｔａｔａｃ ｃｃｔａａａｔｔ...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴秀山，李永青，周亮，朱传炳，袁婺洲，刘明耀，王跃群，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]