一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术公开一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法。其步骤是：状元豆提取得到状元豆粗多糖；D113弱酸性阳离子交换树脂的预处理，去离子水反复浸洗至水澄清无褐色，选取玻璃层析柱，湿法装柱，先用碱和去离子水至pH值为7，后用酸和去离子水洗至pH值为7，去离子水浸泡备用；采用D113弱酸性阳离子交换树脂，以质量浓度为4.0～4.5mg/mL，pH值为5.3～5.8，2.7～3.2BV体积加入状元豆粗多糖，1.4～1.9mL/min流速操作，去除蛋白，脱色，保留多糖。本发明专利技术操作步骤简单，对多糖结构影响小，成本低、环保、吸附快且容量大，树脂可重复使用。

Method for purifying and removing polysaccharides from a champion bean polysaccharide

The invention discloses a method for purifying and removing the polysaccharides from a champion bean polysaccharide. The steps are: brown beans extracted from brown beans polysaccharide; pretreatment of D113 weakly acidic cation exchange resin, deionized water immersion to repeated water clarification without brown, selection of the glass column, wet packing, with alkali and deionized water until the pH value is 7, with acid and deionized water until the pH value 7, deionized water soak; using D113 weakly acidic cation exchange resin, the concentration is 4 ~ 4.5mg/mL, the pH value is 5.3 ~ 5.8, 2.7 ~ 3.2BV volume adding beans champion crude polysaccharide, 1.4 ~ 1.9mL/min flow rate, protein removal, decolorization, retention of polysaccharide. The invention has simple operation steps, little influence on the structure of polysaccharides, low cost, environmental protection, rapid adsorption and large capacity, and the resin can be reused.

【技术实现步骤摘要】
一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法
本专利技术涉及一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法。
技术介绍
目前多糖脱色脱蛋白方法主要有：酶法、有机试剂法(Sevage法、三氯乙酸法等)、吸附法(活性炭法、大孔树脂法等)、过氧化氢氧化法等。其中有机试剂法存在重复次数多、试剂用量大等问题，酶法存在成本较高，且灭活温度高易破坏多糖结构破坏活性等问题，过氧化氢存在易造成多糖降解等问题，活性炭存在脱色时间长，多糖损失量大等问题。而大孔树脂法主要通过范德华力作用或离子交换结合蛋白、色素达到目的，操作步骤简单，对多糖结构影响小，且树脂具有价廉、环保、选择性好、操作简单、吸附快且容量大及可重复使用等优点。
技术实现思路
基于目前尚未见脱除状元豆粗多糖中色素、蛋白质的研究报道，本专利技术的目的在于提供一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，具有操作步骤简单，对多糖结构影响小，且成本低、环保、吸附快且容量大等优点。为了达成上述目的，本专利技术的解决方案是：一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，其步骤如下：第一步，状元豆多糖的提取：将烘干至恒重的状元豆，粉碎过40目筛，索氏提取器中回流4h，回流提取溶剂为乙酸乙酯，回流提取2次，除酯类物质，取出，通风干燥；上述获得的去脂状元豆粉末在超声波装置中水浴提取2h，回流提取3次，再离心取上清液；上清液在旋转蒸发仪中浓缩至含水率为10％±1％，加入乙醇沉淀多糖，4℃冰箱冷藏过夜，4500r/min离心15min取沉淀物，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥得到状元豆粗多糖；第二步，D113弱酸性阳离子交换树脂的预处理：去离子水反复浸洗至水澄清无褐色，选取玻璃层析柱，湿法装柱，先用碱溶液洗脱，再去离子水洗至pH值为7±0.2，接着用酸溶液洗脱后，去离子水洗至pH值为7±0.2，去离子水浸泡备用；第三步，状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化：采用D113弱酸性阳离子交换树脂，以质量浓度为4.0～4.5mg/mL，pH值为5.3～5.8，2.7～3.2BV体积加入状元豆粗多糖，1.4～1.9mL/min流速操作，去除蛋白，脱色，保留多糖。所述第一步，状元豆粉末：乙酸乙酯(g:mL)＝1：200-220，沸点60℃。所述第一步，去脂状元豆粉末：水(g:mL)＝1：30-40，超声功率300W，超声温度50℃，超声时间40min，离心4500r/min，15min。所述第一步，旋转蒸发仪转速120r/min，65℃水浴；离心；无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤用量为沉淀物的2-3倍(m/v)；低温干燥温度在40℃以下，在真空干燥箱中进行。所述第三步，纯化操作后，用20～40％乙醇配制的0.5～2.0mol/L盐酸，以1.0～3.0mL/min流速洗脱1.0～2.5h后，使树脂再生。采用上述方法后，本专利技术利用D113弱酸性阳离子交换树脂(大孔树脂)对状元豆多糖进行脱色脱蛋白，蛋白去除率达89.37～91.11％，脱色率达85.51～87.69％，多糖保留率达93.82～95.22％，可有效提高脱色和脱蛋白率，降低生产成本，减少有机溶剂的使用，同时可最大限度地保护多糖结构，为状元豆粗多糖初步纯化和后期状元豆多糖理化性质及生物活性等研究提供科学依据。与各种其他方法(酶法、Sevage法、活性炭法、TCA法、H2O2等)和静态纯化操作相比，避免了使用有机溶剂，操作简单省时，工艺安全、环保、经济、成本低、吸附快且容量大，树脂可循环再利用，且经其处理后的状元豆多糖更有利于进一步的功能活性研究。附图说明图1是不同再生法的再生效果图。具体实施方式本专利技术以脱色率、蛋白脱除率和多糖保留率为综合评价指标，并引入了综合效应指数客观评价10种大孔树脂对状元豆粗多糖蛋白和色素吸附性能，筛选出效果最佳的树脂，在此基础上，通过单因素试验及利用Design-Expert软件对D113大孔树脂的脱色脱蛋白工艺条件进行分析优化，并对D113树脂再生条件的进行了考察。本专利技术的具体步骤是：一、状元豆多糖的提取将105℃烘干至恒重的状元豆，粉碎过40目筛，索氏提取器中回流4h，除酯类物质，取出，通风干燥。回流提取溶剂为乙酸乙酯，回流提取2次。状元豆粉末：乙酸乙酯(g:mL)＝1：200-220，沸点60℃。获得的去脂状元豆粉在超声波装置中水浴提取2h，回流提取3次，离心取上清液。去脂状元豆粉末：水(g:mL)＝1：30-40，超声功率300W，超声温度50℃，超声时间40min，离心4500r/min，15min。上清液在旋转蒸发仪中浓缩至含水率为10％左右，加入乙醇沉淀多糖，4℃冰箱冷藏过夜，4500r/min离心15min取沉淀物，低温干燥得到状元豆粗多糖。旋转蒸发仪转速120r/min，65℃水浴；沉淀多糖的乙醇用量是4倍量溶液体积，95％浓度；沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥得到状元豆粗多糖。无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤用量为沉淀物的2-3倍(m/v)；低温干燥温度在40℃以下，在真空干燥箱中进)。二、状元豆多糖脱色脱蛋白试验(1)树脂预处理及筛选试验大孔吸附树脂(DA201、AB-8、D-101、HPD100)：去离子水反复浸洗至无泡沫，选取(Φ30mm×650mm)玻璃层析柱，湿法装柱，用95％乙醇以0.5mL/min洗脱至流出液加等量去离子水不变浑浊后，去离子水洗脱至无醇味。去离子水浸泡备用。阴(阳)离子交换树脂(D152、D113、D061、D301R、D370、D290)：去离子水反复浸洗至水澄清无褐色，选取(Φ30mm×650mm)玻璃层析柱，湿法装柱，先用5％NaOH(HCl)溶液以0.5mL/min洗脱8h，再去离子水洗至pH值为6～7，接着用5％HCl(NaOH)溶液以0.5mL/min洗脱8h后去离子水洗至pH值为7左右，去离子水浸泡备用。分别称取预处理好的10种树脂各2.0g，置于150mL具塞磨口锥形瓶中，依次加入30.0mL，5mg/mL的状元豆粗多糖，振荡(25℃，120r/min，6h)，吸附。(2)用吸光度法测多糖、色素及蛋白质含量取供试样品液，用蒸馏水定容至2mL，加人体积分数5％苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5mL，充分混匀，室温静置30min，于490nm波长处测定吸光度。根据吸光度(X)和葡萄糖质量浓度(Y)的回归方程：C＝0.13339A-0.0007(R2＝0.9996，计算多糖质量浓度。以蒸馏水作参比，对状元豆多糖提取液和脱色后的溶液进行紫外全波长扫描，结果发现无最大吸收波长。于200～600nm波长范围内每隔10nm测定吸光度，计算脱色率平均值，以最接近该平均值的420nm作为测定波长，测定状元豆多糖脱色前、后的吸光值。取供试样品液，用蒸馏水定容至1mL，再加入5.0mL考马斯亮蓝备用液，静置15min，蒸馏水作空白对照，于595nm波长处测吸光度，根据吸光度(Y)和牛血清蛋白质量浓度(X)的回归方程：Y＝0.0082X+0.0306(R2＝0.9953，计算蛋白质浓度。综合吸附效应指数ζ(0≤ζ≤1)，ζ＝0.3X1(脱色率)+0.3X2(脱蛋白率)+0.4X3(多糖保留率)，即为树脂的脱色率、蛋白去除率以及多糖保留率的加权和，其值越大表明树脂的综合处理能力越好。测定各树脂平衡液吸光度并计算脱色率、蛋白去本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，其特征在于步骤如下：第一步，状元豆多糖的提取：将烘干至恒重的状元豆，粉碎过40目筛，索氏提取器中回流4h，回流提取溶剂为乙酸乙酯，回流提取2次，除酯类物质，取出，通风干燥；上述获得的去脂状元豆粉末在超声波装置中水浴提取2h，回流提取3次，再离心取上清液；上清液在旋转蒸发仪中浓缩至含水率为10％±1％，加入乙醇沉淀多糖，4℃冰箱冷藏过夜，4500r/min离心15min取沉淀物，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥得到状元豆粗多糖；第二步，D113弱酸性阳离子交换树脂的预处理：去离子水反复浸洗至水澄清无褐色，选取玻璃层析柱，湿法装柱，先用碱溶液洗脱，再去离子水洗至pH值为7±0.2，接着用酸溶液洗脱后，去离子水洗至pH值为7±0.2，去离子水浸泡备用；第三步，状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化：采用D113弱酸性阳离子交换树脂，以质量浓度为4.0～4.5mg/mL，pH值为5.3～5.8，2.7～3.2BV体积加入状元豆粗多糖，1.4～1.9mL/min流速操作，去除蛋白，脱色，保留多糖。

【技术特征摘要】
1.一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，其特征在于步骤如下：第一步，状元豆多糖的提取：将烘干至恒重的状元豆，粉碎过40目筛，索氏提取器中回流4h，回流提取溶剂为乙酸乙酯，回流提取2次，除酯类物质，取出，通风干燥；上述获得的去脂状元豆粉末在超声波装置中水浴提取2h，回流提取3次，再离心取上清液；上清液在旋转蒸发仪中浓缩至含水率为10％±1％，加入乙醇沉淀多糖，4℃冰箱冷藏过夜，4500r/min离心15min取沉淀物，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥得到状元豆粗多糖；第二步，D113弱酸性阳离子交换树脂的预处理：去离子水反复浸洗至水澄清无褐色，选取玻璃层析柱，湿法装柱，先用碱溶液洗脱，再去离子水洗至pH值为7±0.2，接着用酸溶液洗脱后，去离子水洗至pH值为7±0.2，去离子水浸泡备用；第三步，状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化：采用D113弱酸性阳离子交换树脂，以质量浓度为4.0～4.5mg/mL，pH值为5.3～5.8，2.7～3.2BV体积加入状元豆粗多糖，1....

【专利技术属性】
技术研发人员：黎英，林标声，陈雪梅，陈小红，
申请(专利权)人：龙岩学院，
类型：发明
国别省市：福建,35