一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法技术

技术编号：40069845 阅读：9 留言：0更新日期：2024-01-17 00:00

本发明专利技术属于动物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，所述的方法是同时检测PEDV、PEAV、PDCoV和TGEV四种猪肠道病毒的多重TaqMan荧光定量RT‑PCR检测方法。本发明专利技术成功地建立了一种多重TaqMan荧光定量PCR检测方法，用于同时区分TGEV、PEDV、PDCoV和PEAV四种病毒。该方法具有高度稳定性和特异性，可为猪养殖业的健康管理提供有力的工具。此外，该检测方法还可以应用于病毒流行病学调查和疫情监测中，为控制和预防猪病毒感染提供重要的参考。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物病毒学和分子生物学，具体涉及一种pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量检测方法。

技术介绍

1、近年来，传染性腹泻疾病在仔猪中非常常见，该病是导致仔猪死亡的主要原因之一，给养猪业造成极其严重的经济损失。其中，猪流行性腹泻病毒(porcine epidemicdiarrhea virus，pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritisvirus，tgev)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)和猪肠道α冠状病毒(porcine enteric alphacoronavirus，peav)是最主要的病原。这4种病毒均可以导致高度的传染性肠道疾病，经常造成混合感染，临床上较难分辨，主要是引起一周龄以下的仔猪呕吐、严重腹泻以及死亡，因此及早的确诊对该病的防治具有重要意义。

2、由于4种病毒的临床症状和病理变化非常相似，仅靠临床诊断很难区分病原，因此需要借助实验室方法检测。虽然分离鉴定、免疫相关检测手段已经应用于病毒的诊断，但是由于检测条件、时间、准确性等因素的限制，使得现有相关技术不能用于高效快捷的病原确诊。相比较常规的pcr方法只能对病原进行定性检测，难以精确定量，荧光定量pcr可以实现高效的dna定量、定性分析。国内外已有一些学者建立了针对pedv、peav、pdcov、tgev中一种或多种病毒的荧光定量rt-pcr鉴别检测方法。但是，目前尚无同时检测并区分pedv、peav

技术实现思路

1、为解决现有技术中尚无同时检测并区分pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量rt-pcr检测方法的问题，本专利技术提供了一种pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量检测方法，可以同时检测pedv、peav、pdcov和tgev四种猪肠道病毒，为将来的猪腹泻病毒的早期检测和防控提供了重要的实验技术支持及为诊断试剂盒的研制提供一种新的技术手段。

2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：

3、本专利技术提供了一种pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量检测方法，所述的方法是同时检测pedv、peav、pdcov和tgev四种猪肠道病毒的多重taqman荧光定量rt-pcr检测方法；

4、所述taqman荧光定量检测方法包括如下步骤：

5、样品处理：取待测腹泻样品，加入pbs溶液，振荡，离心，取上清液备用；

6、基因组的提取：对得到的上清液提取总rna，然后反转录得到cdna；

7、多重taqman荧光定量rt-pcr扩增反应：以得到的cdna作为检测模版，与pedv、peav、pdcov、tgev病毒的特异性扩增引物以及相对应的taqman荧光探针，在反应体系条件下进行多重taqman荧光定量反应扩增，同时收集荧光信号；

8、结果检测：通过ct值进行结果判定。

9、优选地，离心的条件为：4000～9000r/min离心4～12min。

10、优选地，所述待测腹泻样品包括腹泻猪的肠道组织样本、粪便拭子样本和肛拭子样本。

11、优选地，所述肠道组织样本的样品处理方法包括如下步骤：所述肠道组织样本的样品处理方法包括如下步骤：取病变肠道组织，加入含有pbs溶液的灭菌离心管中，于研磨仪中研磨后，7000～9000r/min离心4～6min，取上清液备用。

12、优选地，所述粪便拭子样本的样品处理方法包括如下步骤：取粪便样本，加入含有pbs溶液的灭菌离心管中，反复振荡2次，7000～9000r/min离心9～11min，取上清液备用；

13、优选地，所述肛拭子样本的样品处理方法包括如下步骤：将肛门拭子样本，加入含有pbs溶液的灭菌离心管内，反复振荡2次，4000～6000r/min离心9～11min，取上清液备用。

14、优选地，所述pedv的特异性扩增引物包括上游引物和下游引物；所述peav的特异性扩增引物包括上游引物和下游引物；所述pdcov的特异性扩增引物包括上游引物和下游引物；所述tgev的特异性扩增引物包括上游引物和下游引物。

15、优选地，所述pedv的特异性扩增引物中的上游引物为pedv-jd180-f，下游引物为pedv-jd180-r，相对应的taqman荧光探针为pedv-p；所述pedv-jd180-f的核苷酸序列如seqid no.1所示，所述pedv-jd180-r的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述pedv-p的核苷酸序列如seq id no.3所示；

16、所述peav的特异性扩增引物中的上游引物为peav-jd120-f，下游引物为peav-jd120-r，相对应的taqman荧光探针为peav-p；所述peav-jd120-f的核苷酸序列如seq idno.4所示，所述peav-jd120-r的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述peav-p的核苷酸序列如seq id no.6所示；

17、所述pdcov的特异性扩增引物中的上游引物为pdcov-jd135-f，下游引物为pdcov-jd135-r，相对应的taqman荧光探针为pdcov-p；所述pdcov-jd135-f的核苷酸序列如seq idno.7所示，所述pdcov-jd135-r的核苷酸序列如seq id no.28所示，所述pdcov-p的核苷酸序列如seq id no.9所示；

18、所述tgev的特异性扩增引物中的上游引物为tgev-jd143-f，下游引物为tgev-jd-143-r，相对应的taqman荧光探针为tgev-p；所述tgev-jd143-f的核苷酸序列如seq idno.10所示，所述tgev-jd-143-r的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述tgev-p的核苷酸序列如seq id no.12所示。

19、优选地，所述多重taqman荧光定量反应扩增时的扩增反应体系溶液具体由以下体积的组分组成：2×animal detectionu probe mastermix：12.5μl，pedv上下游引物各0.5μl，peav上下游引物各0.5μl，pdcov上下游引物各0.5μl，tgev上下游引物各0.5μl；pedv探针0.2μl，pdcov探针0.2μl，peav探针0.5μl，tgev探针0.5μl，模板dna2μl，加入双蒸水将体系补足至25μl。

20、优选地，所述多重taqman荧光定量反应扩增时的反应程序为：95℃预变性30s；循环反应包括95℃10s，60℃30s，共设置45个循环，并在60℃最后一秒设置收集荧光信号。

21、优选地，pbs溶液的ph7.1～本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，其特征在于，所述的方法是同时检测PEDV、PEAV、PDCoV和TGEV四种猪肠道病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法；

2.根据权利要求1所述的一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，其特征在于，离心的条件为：4000～9000r/min离心4～12min。

3.根据权利要求1所述的一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，其特征在于，所述待测腹泻样品包括腹泻猪的肠道组织样本、粪便拭子样本和肛拭子样本。

4.根据权利要求3所述的一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，其特征在于，所述肠道组织样本的样品处理方法包括如下步骤：取病变肠道组织，加入含有PBS溶液的灭菌离心管中，于研磨仪中研磨后，7000～9000r/min离心4～6min，取上清液备用。

5.根据权利要求3所述的一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重Taq

6.根据权利要求3所述的一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，其特征在于，所述肛拭子样本的样品处理方法包括如下步骤：将肛门拭子样本，加入含有PBS溶液的灭菌离心管内，反复振荡2次，4000～6000r/min离心9～11min，取上清液备用。

7.根据权利要求5所述的一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，其特征在于，所述PEDV的特异性扩增引物中的上游引物为PEDV-JD180-F，下游引物为PEDV-JD180-R，相对应的TaqMan荧光探针为PEDV-P；所述PEDV-JD180-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述PEDV-JD180-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述PEDV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

8.根据权利要求1所述的一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，其特征在于，所述多重TaqMan荧光定量反应扩增时的扩增反应体系溶液具体由以下体积的组分组成：2×Animal Detection U Probe Master Mix：12.5μl，PEDV上、下游引物各0.5μl，PEAV上、下游引物各0.5μl，PDCoV上、下游引物各0.5μl，TGEV上、下游引物各0.5μl；PEDV探针0.2μl，PDCoV探针0.2μl，PEAV探针0.5μl，TGEV探针0.5μl，模板DNA2μl，加入双蒸水将体系补足至25μl。

9.根据权利要求1所述的一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，其特征在于，所述多重TaqMan荧光定量反应扩增时的反应程序为：95℃预变性30s；循环反应包括95℃10s，60℃30s，共设置45个循环，并在60℃最后一秒设置收集荧光信号。

10.根据权利要求1所述的一种PEDV、PEAV、PDCoV、TGEV多重TaqMan荧光定量检测方法，其特征在于，PBS溶液的pH7.1～7.3，PBS溶液的浓度为0.1mol/L。

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【技术特征摘要】

1.一种pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量检测方法，其特征在于，所述的方法是同时检测pedv、peav、pdcov和tgev四种猪肠道病毒的多重taqman荧光定量rt-pcr检测方法；

2.根据权利要求1所述的一种pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量检测方法，其特征在于，离心的条件为：4000～9000r/min离心4～12min。

3.根据权利要求1所述的一种pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量检测方法，其特征在于，所述待测腹泻样品包括腹泻猪的肠道组织样本、粪便拭子样本和肛拭子样本。

4.根据权利要求3所述的一种pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量检测方法，其特征在于，所述肠道组织样本的样品处理方法包括如下步骤：取病变肠道组织，加入含有pbs溶液的灭菌离心管中，于研磨仪中研磨后，7000～9000r/min离心4～6min，取上清液备用。

5.根据权利要求3所述的一种pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量检测方法，其特征在于，所述粪便拭子样本的样品处理方法包括如下步骤：取粪便样本，加入含有pbs溶液的灭菌离心管中，反复振荡2次，7000～9000r/min离心9～11min，取上清液备用。

6.根据权利要求3所述的一种pedv、peav、pdcov、tgev多重taqman荧光定量检测方法，其特征在于，所述肛拭子样本的样品处理方法包括如下步骤：将肛门拭子样本，加入含有pbs溶液的灭菌离心管内，反复振荡2次，4000～6000r/min离心9～11min，取上清液备用。

7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：范克伟，戴爱玲，李雨琪，陈芳婷，许静茹，范思思，吴智超，邱淑琪，
申请(专利权)人：龙岩学院，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人