一种靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子的制备方法。采用的靶向分子是一种由赖氨酸、脯氨酸和缬氨酸合成的小分子三肽（Lys‑Pro‑Val,KPV），其作用原理是，寡肽转运蛋白1在健康结肠组织中表达水平极低，而在溃疡性结肠炎组织中高度过量表达，KPV可与寡肽转运蛋白1特异性结合。因此，本发明专利技术通过对纳米粒子进行KPV表面修饰后，能特异性的被溃疡性结肠炎治疗相关关键细胞（结肠上皮细胞和巨噬细胞）高效吞噬，从而介导纳米粒子在结肠炎组织部位的富集。

Method for preparing nano particle modified by three peptide targeted to colitis tissue

The invention discloses a preparation method of nanoparticles modified by three peptides targeting a colitis tissue. The target molecule is composed of a lysine, proline and valine synthetic small molecule peptide three (Lys Pro Val, KPV), its principle is that of peptide transporter 1 in colon tissue of healthy expression level is very low, and in ulcerative colitis tissues highly excessive expression. KPV can be combined with the specific peptide transporter 1. Therefore, the present invention by KPV surface modification of nanoparticles, specific to the relevant key cells in the treatment of ulcerative colitis (colon epithelial cells and macrophages), phagocytosis, which is mediated by the nanoparticles in tissue enriched colitis.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子的制备方法
本专利技术属于纳米药物载体
，具体涉及一种靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子的制备方法和应用。
技术介绍
溃疡性结肠炎是一种慢性肠道炎症疾病，传统的治疗方法治疗效果差，而且会引起较强的毒副作用。现在普遍采用的方式是，把药物制备成靶向给药制剂，把药物靶向递送至病变部位，增强对特定组织的特异性，从而减少全身毒副作用并增强疗效。研究表明，寡肽转运蛋白（Peptidetransporter1，PepT1）在患有溃疡性结肠炎组织的免疫细胞中高度过度表达，这为其靶向治疗提供了一个潜在的靶向位点。小分子三肽（Lys-Pro-Val,KPV）可与PepT1高效结合并被其转运至细胞内，因此，我们可用KPV作为配体分子来对纳米粒子进行表面修饰，从而介导纳米粒子的靶向吞噬，并在病变部位富集。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子的制备方法和应用。这种靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：1）将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Polylactic-co-glycolicacid，PLGA）和香豆素6（Coumarin-6，CM-6）共同溶于2mL二氯甲烷-甲醇混合溶剂中，制成油相；2）将步骤1）的油相逐滴加入到聚乙烯醇和壳聚糖的混合水相溶液中；3）接着超声处理6次，每次10s以形成水包油乳液；4）将步骤3）得到的乳液迅速倒入到聚乙烯醇水相溶液中，形成乳浊液；5）将步骤4）的乳浊液中的有机溶剂在低真空条件下进行挥发；6）将步骤5）挥发后的乳浊液进行离心，收集得到纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；7）将步骤6）得到纳米粒子涡旋分散在异官能团双取代聚乙二醇衍生物：N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酸酐（N-Hydroxysuccinimide-polyethyleneglycol-maleimide，NHS-PEG-MAL）缓冲液中，反应2h；8）离心步骤7）得到的溶液，收集得到纳米粒子，并用去离子水洗涤两次；9）将步骤8）得到的纳米粒子分散在由赖氨酸、脯氨酸和缬氨酸合成的小分子三肽（Lys-Pro-Val,KPV）的水溶液中，反应2h；10）离心步骤9）得到的溶液，收集得到纳米粒子，并用去离子水洗涤两次；11）将步骤10）得到的纳米粒子重新分散在1mL含5%海藻糖的水溶液中；12）将步骤11）得到的溶液进行冻干处理，得到可以用于靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子，保存于-20摄氏度的冰箱中备用。优先的，所述步骤1）中，PLGA和CM-6的质量比例为100mg:4mg~100mg:12mg，二氯甲烷-甲醇溶液的比例为5:5~8:2；所述步骤2）中聚乙烯醇和壳聚糖混合水溶液的总体积为2~6mL，两者的浓度范围分别是2~5%和0.2~0.5%，壳聚糖分子量为1~10×104；所述步骤3）中，超声的参数为超声振幅30~80%。优先的，所述步骤4）中，聚乙烯醇水溶液的总体积为20~200mL，浓度为0~1%；所述步骤6）、步骤8）和步骤10）中，离心速率为8000~20000转/分钟，离心时间为8~40min；所述步骤7）中，溶液中NHS-PEG-MAL的含量为5~20mg；所述步骤9）中，KPV溶液中KPV含量为1~8mg；所述步骤11）中，海藻糖水溶液中海藻糖浓度为5~10%；所述步骤12）中，冷冻干燥的步骤为先在-60~-80摄氏度冷冻过夜，而后置于冻干机中冻干12～36h。相对于现有的技术，本专利技术的优点在于：1）本专利技术以将合成的小分子三肽KPV引入药物靶向递送系统，KPV具有优良的水溶性、生物相容性、非免疫原性、在体内可由酶作用而天然降解。2）本专利技术KPV携带巯基活性基团，便于化学修饰。3）本专利技术KPV对结肠炎组织部位结肠上皮细胞和巨噬细胞上高度过量表达的PepT1粘附性很高，特异性强，吞噬率高。4）本专利技术合成了载CM-6的纳米粒子，并用KPV进行了表面修饰，是对现有的治疗药物的一个突破和重要创新。5）本专利技术首次提出、制备并开展KPV修饰的纳米粒子制剂，这将有助于我们更好揭示纳米粒子递送至病变部位的机理和规律，同时为在分子水平上设计具有更优异效果的载药纳米粒子提供理论依据。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细描述，其中：图1：KPV表面修饰的载CM-6纳米粒子的透射电子显微镜图（a）和粒径分布（b）。图2：流式细胞仪测定巨噬细胞对KPV表面修饰纳米粒子的吞噬情况。图3：表达PepT1和不表达PepT1的结肠上皮细胞对KPV表面修饰纳米粒子的吞噬情况。图4：KPV表面修饰可促进结肠炎症组织对纳米粒子吞噬的荧光图。具体实施方式以下将参照附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例实施例为提供的一种靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子的制备方法，即KPV表面修饰载CM-6纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：1)称量100mgPLGA和8mgCM-6共溶于2mL二氯甲烷-甲醇（8:2）混合溶剂中，制成油相；2)将该油相逐滴加至聚乙烯醇（5%）和壳聚糖（0.5%）的混合水相溶液（4mL）中；3)超声处理6次，每次10s，超声功率为40%，以形成水包油乳液；4)将该乳液迅速倒入40mL聚乙烯醇（0.5%）混合水相溶液中；5)将有机溶剂在低真空条件下挥发；6)离心（12000转/分钟,15min）收集上述纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；7)将纳米粒子涡旋分散在含10mgNHS-PEG-MAL的水溶液中，反应2h；8)离心（12000转/分钟,15min）收集纳米粒子，并用去离子水洗涤两次；9)将纳米粒子涡旋分散在含有2mgKPV的水溶液中，反应2h；10)离心收集（12000转/分钟,15min）纳米粒子，并用去离子水洗涤两次；11)将上述纳米粒子重新分散在1mL含5%海藻糖的水溶液中；12)将上述纳米粒子冻干（-60摄氏度，24h），存于-20摄氏度冰箱。比较例比较例为聚乙二醇修饰的载香豆素6的聚酯纳米粒子制备方法，包括以下步骤：1)称量100mgPLGA和8mgCM-6共溶于2mL二氯甲烷-甲醇（8:2）混合溶剂中，制成油相；2)将该油相逐滴加至聚乙烯醇（5%）和壳聚糖（0.5%）的混合水相溶液（4mL）中；3)超声处理6次，每次10s，超声功率为40%，以形成水包油乳液；4)将该乳液迅速倒入40mL聚乙烯醇（0.5%）混合水相溶液中；5)将有机溶剂在低真空条件下挥发；6)离心（12000转/分钟,15min）收集上述纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；7)将纳米粒子涡旋分散在含10mgNHS-PEG-MAL的水溶液中，反应2h；8)离心（12000转/分钟,15min）收集纳米粒子，并用去离子水洗涤两次；9)将纳米粒子涡旋分散在含有半胱氨酸2mg的水溶液中，反应2h；10)离心收集（12000转/分钟,15min）纳米粒子，并用去离子水洗涤两次；11)将上述纳米粒子重新分散在1mL含5%海藻糖的水溶液中；12)将上述纳米粒子冻干（-60摄氏度，24h），存于-20摄氏度冰箱。图1为KPV表面修饰纳米粒子的透射电子显微镜图（a）和粒径分布图（b）。图1a可以看出，KPV表面修饰纳米粒子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将聚乳酸‑羟基乙酸共聚物（Polylactic‑co‑glycolic acid，PLGA）和香豆素6（Coumarin‑6，CM‑6）共同溶于2 mL二氯甲烷‑甲醇混合溶剂中，制成油相；2）将步骤1）的油相逐滴加入到聚乙烯醇和壳聚糖的混合水相溶液中；3）接着超声处理6次，每次10 s以形成水包油乳液；4）将步骤3）得到的乳液迅速倒入到聚乙烯醇水相溶液中，形成乳浊液；5）将步骤4）的乳浊液中的有机溶剂在低真空条件下进行挥发；6）将步骤5）挥发后的乳浊液进行离心，收集得到纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；7）将步骤6）得到纳米粒子涡旋分散在异官能团双取代聚乙二醇衍生物：

【技术特征摘要】
1.一种靶向结肠炎组织的三肽修饰的纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Polylactic-co-glycolicacid，PLGA）和香豆素6（Coumarin-6，CM-6）共同溶于2mL二氯甲烷-甲醇混合溶剂中，制成油相；2）将步骤1）的油相逐滴加入到聚乙烯醇和壳聚糖的混合水相溶液中；3）接着超声处理6次，每次10s以形成水包油乳液；4）将步骤3）得到的乳液迅速倒入到聚乙烯醇水相溶液中，形成乳浊液；5）将步骤4）的乳浊液中的有机溶剂在低真空条件下进行挥发；6）将步骤5）挥发后的乳浊液进行离心，收集得到纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；7）将步骤6）得到纳米粒子涡旋分散在异官能团双取代聚乙二醇衍生物：N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酸酐（N-Hydroxysuccinimide-polyethyleneglycol-maleimide，NHS-PEG-MAL）缓冲液中，反应2h；8）离心步骤7）得到的溶液，收集得到纳米粒子，并用去离子水洗涤两次；9）将步骤8）得到的纳米粒子分散在由赖氨酸、脯氨酸和缬氨酸合成的小分子三肽（Lys-Pro-Val,KPV）的水溶液中，反应2h；10）离心步骤9）得到的溶液，收集得到纳米粒子，并用去离子水洗涤两次；11）将步骤10）得...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖波，司笑莹，马莉君，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50