一种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法技术

一种基于贵金属等离子共振效应增强上转换纳米材料荧光强度的组装体结构用于超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，涉及纳米材料和分析化学领域。本发明专利技术通过27.1nm粒径的上转换纳米颗粒(NaYF4,Yb,Tm)的合成，4.6nm粒径的金纳米颗粒的合成，上转换纳米粒子的改性，金纳米粒子的包裹，上转换纳米粒子的单链DNA修饰，金纳米粒子表面的单链DNA修饰，粒子间距的系列调控，上转换荧光信号的增强调控以及强度检测，建立荧光信号强度与血管内皮生长因子浓度的标准曲线。本发明专利技术提供了一种基于荧光增强信号测血管内皮生长因子的方法，与传统的检测方法相比背景底，灵敏度高，方便快捷，具有很好的实际应用前景。

Method for ultrasensitive detection of vascular endothelial growth factor based on noble metal plasma effect enhanced upconversion fluorescence structure

The invention relates to a method for super sensitive detection of vascular endothelial growth factor, which is based on the application of noble metal plasma resonance effect to enhance the fluorescence intensity of up conversion nano material. The particle size of 27.1nm on the conversion of nanoparticles (NaYF4, Yb, Tm) synthesis, synthesis of gold nanoparticles by the particle size of 4.6nm, modification of upconversion nanoparticles, gold nanoparticles coated, single stranded DNA modified upconversion nanoparticles, single chain DNA modified gold nanoparticles, particle spacing control series the enhanced detection regulation and intensity of upconversion fluorescence signal, a standard curve of fluorescent intensity and concentration of vascular endothelial growth factor. The invention provides a method for measuring vascular endothelial growth factor based on fluorescence enhancement signal, which has the advantages of high sensitivity, convenience and fast speed compared with the traditional detection method.

【技术实现步骤摘要】

一种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，涉及纳米材料和分析化学领域。
技术介绍
血管内皮生长因子(VEGF)是作用于血管内皮细胞的一类糖蛋白，具有强烈的促内皮细胞增殖作用，促进新血管的形成。而肿瘤组织的生长，须依靠新生血管生成来提供足够的营养物质和氧气来维持，因此，VEGF已被认为是肿瘤标志物。对肿瘤标志物的检测有助于早期发现癌症，实现早期治疗的目的。传统的VEGF检测方法，比如酶联免疫法，对单克隆抗体的要求较高，而且单克隆抗体的筛选是一项繁重且高耗的任务。本专利技术提出了一种新型的、简便的、灵敏的检测方法，其基于贵金属的等离子效应对荧光材料的荧光增强构建了上转换纳米粒子和金纳米颗粒组装体结构。上转换纳米粒子上修饰的适配体因与目标物VEGF亲和力强从而从与VEGF结合而金纳米粒子游离，使得原本由金纳米粒子所提供的等离子效应而增强的荧光信号随着目标物的增加而减弱。据此得到荧光强度与目标物VEGF浓度的标准曲线，实现VEGF浓度的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法。本专利技术的技术方案，一种基于种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，包括上转换纳米粒子的合成、改性和单链DNA或适配体修饰，金纳米粒子合成、包裹及单链DNA修饰、等离子体效应诱导的荧光增强组装体的组装以及VEGF传感器的构建，具体如下：(1)上转换纳米粒子(27.1nm)合成：通过高温热解法制备NaYF4:Yb,Tm上转换纳米颗粒。称取YCl3·6H2O，YbCl3·6H2O，TmCl3·6H2O(Ln：79.5mol％Y3+，20mol％Yb3+，0.5mol％Tm3+，共计1mmol)于100ml三口烧瓶中，加入4mL油酸以及16mL1-十八烯。缓慢搅拌并逐渐升温至160℃，保持30min，自然冷却至室温。准确称取0.1g氢氧化钠和0.148g氟化铵，溶于10mL甲醇溶液混合均匀。将上述溶液缓慢加入三口烧瓶中，升温至50℃，磁力搅拌30min。升温至80℃保持30min缓慢蒸发甲醇，脱气后，将混合液加热到300℃，反应1h。反应结束后，自然冷却到室温，用环己烷和乙醇洗涤三次，分散于5ml环己烷中待用。(2)上转换发光纳米颗粒(UCNP)表面改性及修饰：取30mg步骤(1)中油酸包覆的NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料分散在5ml氯仿和甲苯混合溶液中，体积比为2:3。将其加入到10ml溶解有200mg聚丙烯酸的水溶液中，搅拌24h。离心收集沉淀，清水重复洗涤三次后重悬于10mMTris-HCl中，等体积同浓度六等分，编号依次为UCNP1，UCNP2，UCNP3，UCNP4，UCNP5，UCNP6。分别对应加入5’端巯基修饰的单链DNA序列1，2，3，4，5，6即DNA1，DNA2，DNA3，DNA4，DNA5，DNA6，使其终浓度均为5nM；室温孵育2h后每隔1h加入NaCl溶液,至金纳米粒子溶液中盐粒子浓度为100mM为止，室温孵育过夜，离心除去未结合的单链DNA序列，以10mMTris-HCl缓冲液重悬，形成UCNPx-DNAx(x＝1，2，3，4，5，6)待用。所用单链DNA序列如下：DNA1:5’-SH-TTTGCCTGG-3’；DNA2:5’-SH-TTTCCCTATTAG-3’；DNA3:5’-SH-TTTCGGTAAGTAGAC-3’；DNA4:5’-SH-TTTGGGCTGTTCCGGGTG-3’；DNA5:5’-SH-TTTGGGCTGTTCCGGGTG-3’；DNA6:5’-SH-TTTGCCTGGAGATACATGCACATTACGGCCCCT-3’；(3)金纳米粒子修饰单链DNA：4.6nm粒径的金纳米粒子采用谷胱甘肽还原法合成。金纳米粒子溶液中加入二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，使其终浓度为0.01mg/mL，室温震荡反应包裹12h后，12000rpm离心浓缩十倍，以10mMpH7.4的Tris-HCl缓冲液重悬，溶液等体积同浓度六等分，编号依次为GCAu1，GCAu2，GCAu3，GCAu4，GCAu5，GCAu6。分别对应加入5’端巯基修饰的单链DNA序列1’，2’，3’，4’，5’，6’即DNA1’，DNA2’，DNA3’，DNA4’，DNA5’，DNA6’，使其终浓度均为5nM；室温孵育2h后每隔1h加入NaCl溶液,至金纳米粒子溶液中盐粒子浓度为300mM为止。溶液室温老化24h后离心除去未结合的单链DNA，10mMTris-HCl重悬，形成GCAux-DNAx’(x＝1，2，3，4，5，6)待用。所用单链DNA序列如下：DNA1’:5’-SH-TTTCCAGGC-3’；DNA2’:5’-SH-TTTCTAATAGGG-3’；DNA3’:5’-SH-TTTGTCTACTTACCG-3’；DNA4’:5’-SH-TTTCACCCGGAACAGCCC-3’；DNA5’:5’-SH-TTTGTGCATGTATCTCCAGGC-3’DNA6’:5’-SH-TTTAGGGGCCGTAATGTGCATGTATCTCCAGGC-3’DNAx与DNAx’属对应互补序列(含错配)，通过调控金纳米粒子与上转换粒子的间距实现贵金属等离子效应对上转换纳米颗粒的荧光增强。(4)金纳米等离子体增强荧光结构的构建：将步骤(2)所得四组UCNPx-DNAx溶液与步骤(3)所得GCAux-DNAx’溶液对应并以终浓度1:10混合，使其过夜杂交形成组装体，24h后得金纳米粒子与上转换颗粒组装体结构。(5)等离子体增强荧光效果监测，分别检测步骤(4)所得UCNP-GCAu组装体，比较与原始上转换荧光强度的变化，并确立连接UCNP和GCAu的最佳碱基数目，供后续检测使用。(6)以等碱基数适配体以及其相应互补链取代UCNP和GCAu间的单链DNA，本要求以血管内皮生长因子(VEGF)适配体为例，建立了组装体荧光信号与VEGF浓度的标准曲线：向步骤(5)所制得的组装体结构中分别加入VEGF标准品，使得VEGF终浓度分别为0fM，0.1fM，0.5fM，1fM，5fM，10fM；室温孵育8h后，以980nm波长激光发射器激发上转换和金纳米粒子组装体，在361nm处建立荧光信号强度变化与VEGF浓度的标准曲线。附图说明图1本专利技术所设计的基于等离子共振增强荧光结构的检测原理示意图。图2本专利技术中所用上转换纳米粒子透射电子显微镜照片。图3本专利技术中用谷胱甘肽还原法制备的金纳米颗粒透射电子显微镜照片。图4本专利技术中以单链DNA为骨架组装的等离子共振组装体透射电子显微镜照片。图5本专利技术中荧光增强组装体的荧光强度随血管内皮生长因子的浓度变化荧光图谱。图6本专利技术中在361nm处荧光强度随血管内皮生长因子浓度变化的标准曲线。具体实施方式本专利技术包括但不限于以上实施例，凡是在本专利技术的精神和原则下进行的任何等同替换或者局部改进，都将视为在本专利技术的保护范围之内。实施例1：(1)上转换纳米粒子(27.1nm)合成：通过高温热解法制备NaYF4:Yb,Tm上转换纳米颗粒。称取YCl3·6H2O，YbCl3·6H2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：通过上转换纳米颗粒(NaYF4,Yb,Tm)的合成、金纳米颗粒的合成、上转换纳米粒子的改性，金纳米粒子的包裹，上转换纳米粒子的单链DNA修饰，金纳米粒子表面的单链DNA修饰，粒子间距的系列调控，上转换荧光信号的增强调控以及强度检测，建立荧光信号强度与血管内皮生长因子浓度的标准曲线。

【技术特征摘要】
1.一种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：通过上转换纳米颗粒(NaYF4,Yb,Tm)的合成、金纳米颗粒的合成、上转换纳米粒子的改性，金纳米粒子的包裹，上转换纳米粒子的单链DNA修饰，金纳米粒子表面的单链DNA修饰，粒子间距的系列调控，上转换荧光信号的增强调控以及强度检测，建立荧光信号强度与血管内皮生长因子浓度的标准曲线。2.如权利要求1所述的一种基于贵金属纳米粒子的等离子共振效应增强上转换荧光强度用于高灵敏检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：合成粒径为27.1nm的上转换纳米颗粒，与粒径为4.6nm的金纳米颗粒组装，构建出荧光增强的组装体。3.如权利要求1所述的一种基于贵金属纳米粒子的等离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，赵森，吴世嘉，段诺，马小媛，夏雨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32