本发明专利技术涉及一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括引物、TaqMan荧光探针和阳性标准品，其特征在于：(1)所述的引物为扩增扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因高度保守片段的一对引物，其中，上游引物序列如SEQ NO.1所示，下游引物序列如SEQ NO.2所示；(2)所述的TaqMan荧光探针序列如SEQ NO.3所示；(3)所述的阳性标准品为含有SEQ NO.4所示序列DNA片段的重组质粒。本发明专利技术所述试剂盒具有特异性好、灵敏度高的优点。
【技术实现步骤摘要】
一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法的检测试剂。
技术介绍
埃博拉病毒是一种能引起的人畜共患烈性传染病的丝状病毒科病毒，能引起埃博拉出血热，具有高致病性，病死率高的特点，被世界卫生组织列为对人类危害最严重的病毒之一，生物安全等级4级(BSL-4)。目前，我国扎伊尔型埃博拉病毒常规检测方法有血清学反应、核酸杂交、抗原抗体ELISA等技术，但这些试验或方法，存在操作繁琐，所需时间长(约2天以上)。现有扎伊尔型埃博拉病毒检测技术依然很少，且大多并不可靠，灵敏度低、特异性差。过去推广使用的核酸检测方法于2014年西非疫情中被证实存在严重的假阴性情况，表明扎伊尔型埃博拉病毒检测引物、探针亟需更新。本专利旨在建立一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，对过去的方法进行更新推广。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒具有特异性好、灵敏度高的优点。本专利技术解决上述技术问题的技术方案是：一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括引物、TaqMan荧光探针和阳性标准品，其特征在于：(1)所述的引物为扩增扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因的高度保守片段的一对引物，其中，上游引物序列为：5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’(SEQNO.1)，下游引物序列为：5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’(SEQNO.2)；(2)所述的TaqMan荧光探针序列为：5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ3’(SEQNO.3)；(3)所述的阳性标准品为含有以下序列DNA片段的重组质粒：TGGGACCGGACTGCTGTATCGAACCACATGATTGGACCAAGAACATAACAGACAAAATTGATCAGATTATTCATGATTTTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGGGGGACAATGACAATTGGTGGACAGGATGGAGACAATGGATACCGGCAGGTATTGGAGTTACAGG(SEQNO.4)。上述方案中，所述的阳性标准品由以下方法制得：1)根据网络数据库GenBank上公布的扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因序列，利用Clustal_X软件进行序列同源性分析，然后以blastn网络工具比对分析其特异性，寻找所述编码基因中高度保守区域的氨基酸序列，再按常规方法合成出所述氨基酸序列的DNA片段；2)将步骤(1)合成的DNA片段插入质粒载体pUC57(Amp+)中构建成重组质粒；3)取5μl步骤(1)所得到的重组质粒与100μlDH5α感受态细胞混合后，冰浴20分钟；42℃水浴槽中热冲击70～90秒后，迅速冰浴5分钟；加入500μlLB肉汤培养基，混匀，37℃200rpm摇床培养1小时，得菌液；取100μl菌液在含浓度为100μg/μl的氨苄西林、浓度为20μg/μl的X-gal和浓度为200μg/μl的IPTG的LB培养基平板上进行涂布，培养18小时；然后通过蓝白斑筛选，挑取培养基上的白色菌株进行扩大培养；4)取扩大培养后的白色菌株按Omega公司提供的质粒快速提取试剂盒的要求进行提取，然后用去离子水稀释至106copies/μl即得阳性标准品。本专利技术所述的试剂盒的使用方法如下：(1)反应体系如表1所示：表1本专利技术试剂盒PCR反应体系(3)定量标准曲线制备：将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成109～103copies/μl7个浓度梯度，按照步骤(1)和(2)所述的反应体系和反应程序进行扩增；(4)样品检测：将阳性标准品、阴性对照和待检样品RNA按照上述反应体系进行配制和反应程序进行扩增后，从仪器配套软件中得到各个样品对应Ct值；(5)结果判断：Ct值≤35.0为阳性，无数值或大于35.0为阴性。本专利技术试剂盒与常用的血清学方法类的试剂盒相比具有更高的特异性；与过去的埃博拉病毒荧光定量PCR检测试剂盒相比能更快速准确地检测出扎伊尔型埃博拉病毒，检测时间45min，最低检测下限达到10copies/μl，具有良好的特异性，可用于临床诊断，传染病疫情预防监控，出入境检验检疫及其相关领域的扎伊尔型埃博拉病毒的定性和定量快速实时核酸检测。附图说明图1为所述编码基因中高度保守区域的氨基酸序列SEQNO.4在扎伊尔型埃博拉病毒基因组中的位置图。图2为采用本专利技术所述试剂盒进行PCR扩增后所绘制的标准曲线。图3为实施例2中本专利技术试剂盒敏感性测定结果的曲线图，图中自左向右依次为起始模板浓度分别是106、105、104、103、102、101copies/μl的扩增曲线，最下面靠近横坐标的曲线(Ct值很小的)为阴性对照。图4为实施例2中本专利技术试剂盒特异性测定结果的曲线图，图中自左向右对应起始模板分别是阳性标准品、含重组质粒的DH5ɑ工程菌的扩增曲线，无Ct值曲线的模板是I型登革病毒RNA、寨卡病毒RNA、阴性对照的扩增曲线。具体实施方式下面将结合实施例来说明本专利技术具有的有益效果。实施例1：(制备试剂盒)1、检测扎伊尔型埃博拉病毒荧光定量PCR试剂盒的组成：上游引物：5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’，10μM；下游引物：5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’，10μM；荧光探针：5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ3’，10μM；阳性标准品：含有DNA片段SEQNO.4的pUC57(Amp+)重组质粒，浓度是106copies/μl。聚合酶混合液：含5U/μlTaqDNA聚合酶和200U/μl逆转录酶，购自北京康润诚业生物科技有限公司；PCR反应缓冲液(5×)：购自北京康润诚业生物科技有限公司；上述核酸均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。2、所述定量阳性模板的制备方法是：(1)根据网络数据库GenBank上公布的扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因序列，利用Clustal_X软件进行序列同源性分析，然后以blastn网络工具比对分析其特异性，寻找编码基因中具有高度保守的区域，然后提交序列信息由生工生物工程(上海)股份有限公司合成SEQNO.4的DNA片段；(2)将该片段插入质粒载体pUC57(Amp+)中构建成重组质粒，具体方法是：a.DNA片段SEQNO.4与质粒载体pUC57(Amp+)的连接和转化：1)在微量离心管中加入：pUC57(Amp+)1μlDNA片段(SEQNO.4)4μldH2O4μl；2)加入1μl的T4DNALigase；3)16℃反应过夜，连接；4)取感受态细胞DH5α100μl于离心管，置于冰中预冷20min；5)加入连接产物5μl；6)轻轻混匀后冰中预冷30min；7)42℃70～90S热冲击处理；8)迅速移至冰中冷却5min；9)加入37℃LB液体培养基500μl；10)37℃、200r/min振荡培养1h；11)取100μl培养基涂布于含100μg/μl氨苄西林、20μg/μlX-gal、200μg/μlIPTG的LB培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括引物、TaqMan荧光探针和阳性标准品，其特征在于：(1)所述的引物为扩增扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因的高度保守片段的一对引物，其中，上游引物序列为：5’‑GAACCACATGATTGGACCAAGA‑3’(SEQ NO.1)，下游引物序列为：5’‑TAACTCCAATACCTGCCGGTATC‑3’(SEQ NO.2)；(2)所述的TaqMan荧光探针序列为：5’FAM‑TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG‑BHQ 3’(SEQ NO.3)；(3)所述的阳性标准品为含有以下序列DNA片段的重组质粒：TGGGACCGGACTGCTGTATCGAACCACATGATTGGACCAAGAACATAACAGACAAAATTGATCAGATTATTCATGATTTTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGGGGGACAATGACAATTGGTGGACAGGATGGAGACAATGGATACCGGCAGGTATTGGAGTTACAGG(SEQ NO.4)。
【技术特征摘要】
1.一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括引物、TaqMan荧光探针和阳性标准品，其特征在于：(1)所述的引物为扩增扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因的高度保守片段的一对引物，其中，上游引物序列为：5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’(SEQNO.1)，下游引物序列为：5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’(SEQNO.2)；(2)所述的TaqMan荧光探针序列为：5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ3’(SEQNO.3)；(3)所述的阳性标准品为含有以下序列DNA片段的重组质粒：TGGGACCGGACTGCTGTATCGAACCACATGATTGGACCAAGAACATAACAGACAAAATTGATCAGATTATTCATGATTTTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGGGGGACAATGACAATTGGTGGACAGGATGGAGACAATGGATACCGGCAGGTATTGGAGTTACAGG(SEQNO.4)。2.根据权利要求1所述的一种检测扎伊尔型埃博拉病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：万成松，李以圣，张宝，赵卫，张其威，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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