制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体技术

本发明专利技术提供一种制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体，所述方法包括以下步骤：用纯化的融合蛋白ACP‑CaM与佐剂免疫小鼠；用生理盐水稀释的融合蛋白ACP‑CaM腹腔冲击小鼠；取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞；用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％；排除抗体与标签蛋白ACP有交叉反应的阳性杂交瘤细胞；采用小鼠体内诱生腹水法制备钙调蛋白单克隆抗体；纯化所述钙调蛋白单克隆抗体。通过本发明专利技术方法制备的钙调蛋白单克隆抗体具有高效价、高稳定性和高特异性。

Process for preparing monoclonal antibodies against tapioca calmodulin and antibodies prepared by the method

The present invention provides a method for preparing antibody of cassava calmodulin monoclonal antibodies and the preparation method, the method comprises the following steps: ACP CaM and protein adjuvant in mice immunized with the purified fusion protein; ACP CaM shock mice peritoneal fusion diluted with normal saline; the mice spleen cells and bone marrow tumor cell fusion; fusion by HAT after cultured and indirect ELISA screening, obtained positive hybridoma cells; the positive hybridoma cells were cloned by limiting dilution until the positive clone rate was 100%; exclusion of positive hybridoma cell antibody and ACP tag protein cross reacted with mice induced ascites; preparation of monoclonal antibodies against the purified Calmodulin; Calmodulin monoclonal antibody. The monoclonal antibody against calmodulin prepared by the method of the invention has high efficiency, high stability and high specificity.

【技术实现步骤摘要】
制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体
本专利技术涉及单克隆抗体
，尤其涉及制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体。
技术介绍
木薯(ManihotesculantaCrantz)中NADH-氧化酶表达上调产生大量ROS，诱导钙调蛋白(Calmodulin,CaM)上调，从而启动一系列的生物防御反应，提高抗逆蛋白质的表达从而延长块根贮藏时间，推测CaM在木薯块根采后腐烂中起重要的调节作用(简纯平.采后木薯块根贮存能力及蛋白质组学分析[D].海口:海南大学,2013；张振文.木薯块根采后生理的蛋白质调控机理研究[D].海口:海南大学,2012)。研究表明，不同生物或非生物的刺激，如病虫害(朱友林,吴健胜,王金生.水稻对白叶枯病菌抗性相关蛋白的双向电泳分析[J].中国农业科学,2000,33(4):91-93；陈荣智,翁清妹,黄臻,等.水稻对褐飞虱抗性相关蛋白的双向电泳分析(英文)[J].植物学报(英文版),2002,44(4):427-432；ALIGS,REDDYVS,LINDGRENPB,etal.Differentialexpressionofgenesencodingcalmodulin-bindingproteinsinresponsetobacterialpathogensandinducersofdefenseresponses[J].PlantMolecularBiology,2003,51(6):803-815)、缺氧(SHIJX,ChenS,NATANG,etal.Effectsofanaerobicstressontheproteomeofcitrusfruit[J].PlantScience,2008,175(4):478-486)、高盐(蔡伦,张富春,曾幼玲,等.新疆盐生植物的钙调蛋白基因克隆与序列分析[J].植物生理学通讯,2005,41(02):163-167.；CHENS,GOLLOPN,HEUERB.Proteomicanalysisofsalt-stressedtomato(Solanumlycopersicum)seedlings:effectofgenotypeandexogenousapplicationofglycinebetaine[J].JournalofExperimentalBotany,2009,60(7):2005-2019)、重金属(孙鹂.铅对细胞内钙离子及钙调蛋白影响的研究进展[J].国外医学卫生学分册,2002,29(6):328-330)和温度(MAJOULT,BANCELE,TRIBOIE,etal.Proteomicanalysisoftheeffectofheatstressonhexaploidwheatgrain:Characterizationofheat-responsiveproteinsfromnon-prolaminsfraction[J].Proteomics,2004,3(2):175-183)胁迫等，可以改变植物CaM基因的表达分布，只是在不同组织和器官中的含量和分布不同(刘维.番茄钙调蛋白和类钙调蛋白的抗病调控功能分析[D].杭州:浙江大学,2015)。作为抗逆信号转导中重要的蛋白，研究CaM含量在不同木薯品种、不同器官和不同时期含量变化非常必要。目前CaM的测定方法主要有免疫学方法、凝胶电泳法和酶法(梁婧,张晓蓉,许艳华.钙调蛋白的研究进展[J].临床口腔医学杂志,2010,26(08):500-501)。凝胶电泳法因为检测不准确，所以用的比较少；酶法能检测有活性的CaM，但是测定过程中容易受到干扰而导致测定值偏低；免疫学方法主要有放射免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)，这两种方法检测都是以抗原抗体特异性结合为基础，两者都需要制备CaM抗体(梁婧,张晓蓉,许艳华.钙调蛋白的研究进展[J].临床口腔医学杂志,2010,26(08):500-501)。免疫学检测方法特异性强，受待测样本中非CaM成分干扰相对小，能检测CaM总量，但是不能确定CaM活性含量(王娟,李晓军,潘继文,等.钙调素ELISA定量检测方法的建立与实验条件优化[J].医学研究生学报,2003,16(6):401-403)。随着木薯全基因组测序工作的完成及基因数据库的构建(WANGW,FENGB,XIAOJ,etal.Cassavagenomefromawildancestortocultivatedvarieties[J].NatureCommunications,2013,10(5):5110)，免疫学技术结合蛋白质组学的研究在木薯高效、高产、特用育种和关键蛋白表达调控机制研究通路中的应用将会变得越来越重要(陈松笔,安飞飞,朱文丽,等.蛋白质组学在木薯育种中的应用[J].生物技术通报,2015,31(11):18-26)。CaM在真核细胞的进化过程中高度保守，甚至在脊椎动物中具有完全一样的一级结构；在植物中，钙调蛋白的一级结构相似程度也在90％以上(ZHAOS,CHEND,GENGQ,etal.ThehighlyconservedLAMMER/CLK2proteinkinasespreventgermcelloverproliferationindrosophila[J].DevelopmentalBiology,2013,376(2):163-70)，在更低级的生物中序列差异越来越大(刘维.番茄钙调蛋白和类钙调蛋白的抗病调控功能分析[D].杭州:浙江大学,2015)。CaM是由148个氨基酸残基组成的小分子蛋白，由于其一级结构在进化上高度保守，抗原表位较少，用常规方法极难制备出特异性强的优质抗体(王娟,李晓军,潘继文,等.钙调素ELISA定量检测方法的建立与实验条件优化[J].医学研究生学报,2003,16(6):401-403)。因此，本领域需要有效的木薯钙调蛋白单克隆抗体制备方法及其制备的抗体，用于快速检测CaM在木薯不同品种(系)、不同器官和不同时期的分布和含量变化。
技术实现思路
本专利技术人首次从木薯中克隆钙调蛋白基因，体外表达CaM蛋白，免疫小鼠制备其单克隆抗体，为快速检测CaM在木薯不同品种(系)、不同器官和不同时期的分布和含量变化提供优良抗体，也可为木薯采后生理腐烂调控机理的研究提供材料。因此，本专利技术提出一种钙调蛋白单克隆抗体的制备方法，获得的钙调蛋白单克隆抗体具有高效价和高稳定性。因此，在第一方面，本专利技术提供了一种木薯钙调蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1)用融合蛋白ACP-CaM与佐剂一起免疫小鼠；2)用含融合蛋白ACP-CaM的溶液腹腔冲击所述小鼠；3)取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；4)筛选获得阳性杂交瘤细胞；5)对所述阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％；6)在所述阳性单克隆率为100％的阳性杂交瘤细胞中，排除其抗体与标签蛋白ACP有交叉反应的阳性杂交瘤细胞；7)将步骤6)中获得的阳性杂交瘤细胞获得并纯化所述钙调蛋白单克隆抗体。在一个实施方案中，步骤1)中的融合蛋白ACP-CaM的制备步骤包括：a)将载体pET-16b的EcoRI酶切位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)用融合蛋白ACP‑CaM与佐剂一起免疫小鼠；2)用含融合蛋白ACP‑CaM的溶液腹腔冲击所述小鼠；3)取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；4)筛选获得阳性杂交瘤细胞；5)对所述阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％；6)在所述阳性单克隆率为100％的阳性杂交瘤细胞中，排除其抗体与标签蛋白ACP有交叉反应的阳性杂交瘤细胞；7)将步骤6)中获得的阳性杂交瘤细胞获得并纯化所述钙调蛋白单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)用融合蛋白ACP-CaM与佐剂一起免疫小鼠；2)用含融合蛋白ACP-CaM的溶液腹腔冲击所述小鼠；3)取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；4)筛选获得阳性杂交瘤细胞；5)对所述阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％；6)在所述阳性单克隆率为100％的阳性杂交瘤细胞中，排除其抗体与标签蛋白ACP有交叉反应的阳性杂交瘤细胞；7)将步骤6)中获得的阳性杂交瘤细胞获得并纯化所述钙调蛋白单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的所述融合蛋白ACP-CaM的制备方法包括：a)将载体pET-16b的EcoRI酶切位点后插入SEQIDNO.5，得到表达载体；b)用上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2，以木薯块根cDNA为模板，采用PCR扩增目的片段；c)将所述扩增的片段回收后与所述表达载体分别用BamHI/XhoI双酶切、回收、连接，宿主细胞中扩增，取质粒进行测序鉴定，鉴定质粒；d)将所述质粒转化到宿主菌中，用IPTG诱导表达，分离纯化蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧文军，余厚美，安飞飞，罗秀芹，秦于玲，陈松笔，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46