使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法及得到的CIK细胞技术

本发明专利技术公开了一种使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法及得到的CIK细胞，该细胞培养方法能够在不引入动物源血清的情况下短时间培养出3*10

Methods for culturing and cryopreserved CIK cells using serum-free lymphocyte cultures and CIK cells obtained

The invention discloses a method for using serum-free medium and cell cryopreservation of CIK cells and CIK cells, the cell culture method to cultivate 3*10 in a short time without introducing animal serum case

【技术实现步骤摘要】
使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法及得到的CIK细胞
本专利技术涉及细胞生物
，尤其是一种使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法及得到的CIK细胞，是一套可标准化生产操作的方法。
技术介绍
2000年国际肿瘤生物治疗及基因治疗年会中指出“免疫细胞疗法是现代科技中唯一有可能彻底清除癌症细胞的方法”。梦想照进现实，癌症正在逐渐被我们战胜。细胞免疫疗法是除手术、放疗、化疗以外的第四大癌症治疗模式。但增龄与疾病时刻挑战着我们的免疫系统，储存年轻正常的自体免疫细胞变得十分必要。世界范围的免疫细胞库建设已具有一定规模。目前主流的冻存方法是直接冻存PBMC或扩增完成后冻存。直接冻存PBMC细胞冻存数量较少，且细胞活力较对数期生长细胞低，加上冻存细胞成分的复杂性，复苏后大量细胞死亡，影响后期培养。扩增完成后冻存细胞工作量较大，且复苏细胞活性不能很好保证。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种CIK细胞的简便安全的使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法及得到的CIK细胞。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法，采用联合包被技术，在CIK细胞培养过程中用多种细胞因子诱导细胞扩增，增强杀伤活性；利用自体血清配置冻存液，并选取对数期生长细胞冻存。具体地,包括如下步骤:(1)用含Retronectin和CD3mAb蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被培养瓶，CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜；(2)采集常规外周血或脐带血，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，2000rpm/min，离心25min；(3)收集步骤(2)中上层血浆，将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体；3000rpm/min，离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管，放置于4℃冰箱备用；(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞，洗两次，获得全部的单核细胞；(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,重悬细胞并按照细胞接种密度(2-10)*105/ml加入无血清淋巴细胞培养基，补加步骤(3)中备用的自体血清和INF-γ，并将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；(6)培养第1天，补加IL-1α、IL-2；(7)培养第5天，取刚进入对数期生长的CIK细胞，制备单细胞悬液，并对细胞进行计数，细胞计数后以1500rpm/min，离心6min，倒弃上清液；(8)取步骤(3)中备用的自体血清，与DMSO按比例配置细胞冻存液；(9)根据计数，调整细胞冻存浓度，加入低温冻存液重悬细胞，并将冻存终细胞悬液分装至冻存管中，按照程序降温冻存细胞。所述步骤(1)中预包被培养瓶使用0.5-1ug/ml的Retronectin和2-5ug/mlCD3mAb蛋白联合包被。所述步骤(5)中培养第0天补加INF-γ终浓度为500-1000U/ml,按体积百分比，加入自体血清为培养体系的5％-10％。所述步骤(6)中培养第一天补加IL-1α终浓度为0.05-0.2U/ml、IL-2终浓度为500-1000U/ml。所述步骤(8)中细胞冻存液采用自体血清和DMSO按照体积比例9:1配制。所述步骤(9)中冻存细胞终浓度确定为(1-2)*107/ml。上述使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法得到的CIK细胞。本专利技术的有益效果:本专利技术培养方法能短时间内扩增出3*109以上的淋巴细胞，其中CIK(CD3+CD56+)比例达到25％以上；该细胞冻存方法够在不引入外源动物血清的情况下保证细胞特性不变，提高冻存复苏细胞活性，保证扩增效率。附图说明图1是本专利技术实施例1细胞流式检测图。具体实施方式本专利技术使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法，该细胞培养方法采用联合包被技术，并在CIK细胞培养过程中用多种细胞因子诱导细胞扩增，增强其杀伤活性；细胞冻存方法利用自体血清配置冻存液，并恰当选取对数期生长细胞冻存。包括如下步骤:(1)用含Retronectin和CD3mAb蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被培养瓶，CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜；(2)采集常规外周血或脐带血，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，2000rpm/min，离心25min；(3)收集步骤(2)中上层血浆，将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体；3000rpm/min，离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管，放置于4℃冰箱备用；(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞，洗两次，获得全部的单核细胞；(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,重悬细胞并按照细胞接种密度(2-10)*105/ml加入无血清淋巴细胞培养基，补加步骤(3)中备用的自体血清和INF-γ，并将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；(6)培养第1天，补加IL-1α、IL-2；(7)培养第5天，取刚进入对数期生长的CIK细胞，制备单细胞悬液，并对细胞进行计数，细胞计数后以1500rpm/min，离心6min，倒弃上清液；(8)取步骤(3)中备用的自体血清，与DMSO按比例配置细胞冻存液；(9)根据计数，调整细胞冻存浓度，加入低温冻存液重悬细胞，并将冻存终细胞悬液分装至冻存管中，按照程序降温冻存细胞。所述步骤(1)中预包被培养瓶使用0.5-1ug/ml的Retronectin和2-5ug/mlCD3mAb蛋白联合包被。所述步骤(5)中培养第0天补加INF-γ终浓度为500-1000U/ml,按体积百分比，加入自体血清为培养体系的5％-10％。所述步骤(6)中培养第一天补加IL-1α终浓度为0.05-0.2U/ml、IL-2终浓度为500-1000U/ml。所述步骤(8)中细胞冻存液采用自体血清和DMSO按照体积比例9:1配制。所述步骤(9)中冻存细胞终浓度确定为(1-2)*107/ml。上述使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法得到的CIK细胞。具体地说,包括如下步骤:(1)用10ml含Retronectin和CD3mAb蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被一个T175培养瓶，CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜；(2)取采集常规外周血或脐带血60ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，2000rpm/min，离心25min；(3)收集步骤(2)中上层血浆于50ml离心管并编号，将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体；3000rpm/min，离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至新的离心管，并放置于4℃冰箱备用；(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞，洗两次，最终获得(4-10)*107个单核细胞；(5)取步骤(1)中包被的T175培养瓶,重悬细胞并按照细胞接种密度(2-5)*105/ml加入无血清淋巴细胞培养基(LONZA公司的X-VIVO15培养基)至T175细胞培养瓶中，并按照培养体系补加上述自体血清和INF-γ，并将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；(6)培养第1天，按照培养体系加入IL-1α、IL-2；(7)培养第5天，取刚进入对数期生长的CIK细胞，制备单细胞悬液，并对细胞进行计数，细胞计数后以1500rpm/min，离心6min，倒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法，其特征在于，采用联合包被技术，在CIK细胞培养过程中用多种细胞因子诱导细胞扩增，增强杀伤活性；利用自体血清配置冻存液，并选取对数期生长细胞冻存。

【技术特征摘要】
1.一种使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法，其特征在于，采用联合包被技术，在CIK细胞培养过程中用多种细胞因子诱导细胞扩增，增强杀伤活性；利用自体血清配置冻存液，并选取对数期生长细胞冻存。2.根据权利要求1中所述使用无血清淋巴细胞培养基培养及冻存CIK细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)用含Retronectin和CD3mAb蛋白的无血清淋巴细胞培养基包被培养瓶，CO2培养箱孵育2小时或4℃过夜；(2)采集常规外周血或脐带血，Ficoll-Hypaque密度梯度离心，2000rpm/min，离心25min；(3)收集步骤(2)中上层血浆，将收集的血浆置于56℃水浴锅30min以灭活补体；3000rpm/min，离心6min除去血浆中析出物,并将上层自体血清转移至离心管，放置于4℃冰箱备用；(4)收集步骤(2)中的白膜层细胞，洗两次，获得全部的单核细胞；(5)取步骤(1)中包被的培养瓶,重悬细胞并按照细胞接种密度(2-10)*105/ml加入无血清淋巴细胞培养基，补加步骤(3)中备用的自体血清和INF-γ，并将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；(6)培养第1天，补加IL-1α、IL-2；(7)培养第5天，取刚进入对数期生长的CIK细胞，制备单细胞悬液，并对细胞进行计数，细胞计数后以1500rpm/min，离心6min，倒弃上清液；(8)取步骤(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊亮，张冰晶，鲁振宇，韩洪起，秦臻，刘俊江，徐悦，黄文敬，
申请(专利权)人：天津普瑞赛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12