制备纯化的磷酸二阿米迪特的方法技术

本发明专利技术公开一种可大规模纯化磷酸二阿米迪特的方法，该方法包括如下步骤：在非极性有机溶剂中溶解粗磷酸二阿米迪特，使该非极性有机溶剂与含有极性有机溶剂的极性相接触以从溶解的磷酸二阿米迪特中除去杂质，及从磷酸二阿米迪特中除去该非极性有机溶剂。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备具有提高纯度的磷酸二阿米迪特(phosphorodiamidite)的方法。本专利技术还提供使用这种纯化的磷酸二阿米迪特的方法。
技术介绍
众所周知大多数哺乳动物的身体状态(包括大多数疾病状态)受蛋白的影响。这种直接作用或通过其酶作用的蛋白是动物和人所患的众多疾病的主要原因。常规的治疗方法通常集中于与这种蛋白的相互作用，以缓和它们的疾病诱因或疾病加强作用。然而，近来已偿试通过与指导它们合成的分子(如细胞内RNA)的相互作用来缓和这种蛋白的实际产生。通过干扰蛋白的产生，可以预期到能够实现最大程度的治疗效果和最低的副作用。这种治疗手段的一般目的是干扰或以其它方式调节引起所不需要的蛋白形成的基因表达。一种抑制特异性基因表达的方法是使用寡核苷酸和寡核苷酸类似物作为″反义″药剂。使用对特异性目标信使RNA(mRNA)序列互补的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。反义方法经常涉及到相对较短的寡核苷酸和寡核苷酸类似物互补杂交成单链mRNA或单链DNA，从而这些细胞内核酸的正常必要的功能被破坏。杂交是寡核苷酸或寡核苷酸类似物的序列特异性的氢与RNA或单链DNA的Watson-Crick碱基对结合。据说这种碱基对可以彼此互补。现在寡核苷酸和寡核苷酸类似物被用作治疗药剂，对于治疗和诊断方法而言其具有很大前景。寡核苷酸和寡核苷酸类似物可作为治疗用和诊断用的反义药剂及研究试剂，这经常需要大量合成寡核苷酸或寡核苷酸类似物。三种基本方法被用来合成寡核苷酸。如Reese，Tetrahedron 1978，34，3143中所述的磷酸三酯方法；如Beaucage，Methods in MolecularBiologyProtocols for Oligonucleotids and Analogs；Agrawal，Ed.；Humana PressTotowa，1993，Vol.20，33-61中所述的磷酸阿米迪特(phosphoramidite)方法；如Froehler，Methods in Molecular BiologyProtocols for Oligonucleotids and Analogs；Agrawal，Ed.；Humana PressTotowa，1993，Vol.20，63-80中所述的H-膦酸酯方法。磷酸三酯技术已被广泛用于溶液相合成，而磷酸阿米迪特和H-膦酸酯技术主要用于固体相合成中。Reese已经报导了寡核苷酸的溶液相合成在H-膦酸酯联接上的应用。参见Reese等人的Nucleic AcidsResearch，1999，27，963-971及Reese等的Biorg.Med.Chem.Lett.1997，7，2787-2792。鉴于寡核苷酸在治疗、分析、基因组及其它用途中的潜在应用，因而需要大量制备寡核苷酸。扩大磷酸阿米迪特寡核苷酸合成的首要条件是扩大磷酸二阿米迪特前体的制备。由于磷酸二阿米迪特中的杂质将影响产物的纯度，因此磷酸二阿米迪特必须具有异常高的纯度。然而，常规纯化磷酸二阿米迪特的方法包括在高温高真空下蒸馏(例如100℃和0.5mmHg)，因而是不经济的，这是由于蒸馏所需的时间随着规模扩大而增加，这将引起磷酸二阿米迪特产物分解。因此需要一种纯化磷酸二阿米迪特的大规模的经济方法。专利技术概述上述和其它需要可通过本专利技术的实施方案来实现，本专利技术提供一种纯化磷酸二阿米迪特的方法，该方法包括在非极性有机溶剂中溶解含有至少一种杂质的粗磷酸二阿米迪特组合物以形成非极性相，使该非极性相与含有极性有机溶剂的极性相接触以使该杂质的至少一部分从该非极性相分配进该极性相；及使该极性相与该非极性相分离以制得在非极性有机溶剂中的纯化的磷酸二阿米迪特。上述和其它需要可通过本专利技术的实施方案来实现，本专利技术提供一种，该方法包括在非极性有机溶剂中溶解含有至少一种杂质的粗磷酸二阿米迪特以形成非极性相，使该非极性相与含有极性有机溶剂的极性相接触以使该杂质的至少一部分从该非极性相分配进该极性相；使该极性相与该非极性相分离；及使该非极性有机溶剂与磷酸二阿米迪特分离以制得纯化的磷酸二阿米迪特。上述和其它需要可通过本专利技术的实施方案来实现，本专利技术提供一种，该方法包括制备含有至少一种杂质的粗磷酸二阿米迪特，在非极性有机溶剂中溶解该粗磷酸二阿米迪特以形成非极性相，使该非极性相与含有极性有机溶剂的极性相接触以使该杂质的至少一部分从该非极性相分配进该极性相；使该极性相与该非极性相分离；及使该非极性有机溶剂与磷酸二阿米迪特分离以制得纯化的磷酸二阿米迪特。上述和其它需要可通过本专利技术的实施方案进一步来实现，本专利技术提供一种制备磷酸阿米迪特的方法，该方法包括在非极性有机溶剂中溶解含有至少一种杂质的粗磷酸阿米迪特以形成非极性相，使该非极性相与含有极性有机溶剂的极性相接触以使该杂质的至少一部分从该非极性相分配进该极性相，从而制得在该非极性相中的纯化的磷酸二阿米迪特，及使该磷酸二阿米迪特与核苷反应以形成该磷酸阿米迪特。上述和其它需要可通过本专利技术的实施方案进一步来实现，本专利技术提供一种制备寡核苷酸的方法，该方法包括在非极性有机溶剂中溶解含有至少一种杂质的粗磷酸阿米迪特以形成非极性相，使该非极性相与含有极性有机溶剂的极性相接触以使该杂质的至少一部分从该非极性相分配进该极性相，从而制得在该非极性相中的纯化的磷酸二阿米迪特，使该磷酸二阿米迪特与核苷反应以形成该磷酸阿米迪特，及进一步使该磷酸阿米迪特与核苷的活性羟基或寡核苷酸的n-mer(n-部分)以形成寡核苷酸的n+1-mer。在本专利技术某些优选的实施方案中，本专利技术的方法包括在非极性有机溶剂中溶解粗磷酸二阿米迪特组合物以形成非极性相，使该非极性相与含有极性有机溶剂的极性液体溶液接触以使该杂质的至少一部分从该非极性相分配进该极性相以制得在非极性相中的纯化的磷酸二阿米迪特，该粗磷酸二阿米迪特组合物含有至少一种杂质和如下式I所示的化合物 其中G1是OR1或SR1，R1是保护基，G2和G3中的每个均为胺。专利技术详细说明本专利技术提供一种纯化磷酸二阿米迪特的改进方法，该方法包括在非极性有机溶剂中溶解含有至少一种杂质的粗磷酸二阿米迪特组合物以形成非极性相，使该非极性相与含有极性有机溶剂的极性相接触以使该杂质的至少一部分从该非极性相分配进该极性相；及使该极性相与该非极性相分离以制得在非极性有机溶剂中的纯化的磷酸二阿米迪特。本专利技术的方法完全可大规模进行，能够制备100g、1kg、10kg和更大量的磷酸二阿米迪特，其足以用于大规模的寡核苷酸合成中。原则上本专利技术的方法不限制规模，其仅受反应器尺寸的限制。因而本专利技术的方法可提供足量的磷酸二阿米迪特，并用来在制药业中大量制备药物级寡核苷酸。本专利技术的方法在磷酸二阿米迪特的应用中是足够经济的，而其又可在寡核苷酸(包括改性的寡核苷酸和寡核苷酸类似物)的制备中用作前体，寡核苷酸可用于诊断、研究、分析和其它目的。本专利技术的方法在本文中可被称为磷酸二阿米迪特纯化方法。纯化方法的第一步包括在非极性有机溶剂中溶解含有磷酸二阿米迪特(粗磷酸二阿米迪特)和至少一种杂质的粗合物以形成非极性相。从而形成含有磷酸二阿米迪特和至少一种杂质的非极性相。纯化方法的第二步包括使该非极性相与含有至少一种极性有机溶剂的极性相接触。由于非极本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备纯化的磷酸二阿米迪特的方法，所述方法包括如下步骤：ａ．在非极性相中溶解含有至少一种杂质的粗磷酸二阿米迪特；及ｂ．使所述非极性相与含有极性有机溶剂的极性相接触，由此所述杂质的至少一部分转移到所述极性相中，并在所述非极性 相中制得纯化的磷酸二阿米迪特。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋全来，布鲁斯罗斯，
申请(专利权)人：ISIS药物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]