本发明专利技术公开了一种电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用，特点是包括将氧化石墨烯进行羧基化得到羧基化的氧化石墨烯溶液，然后依次加入偶联试剂、anti‑CA1252和Ru‑NH2得到第一信号单元的步骤；将氮化碳薄膜溶液加入胶体金溶液中得到AuNPs/g‑C3N4溶液；然后加入anti‑SCCA2溶液得第二信号单元的步骤；最后将金电极插入anti‑CA1251和anti‑SCCA1的混合溶液中，然后孵育在含有CA125和SCCA的待测混合溶液中，再置于含有第一信号单元和第二信号单元的混合溶液中孵育即可，优点是操作简单，特异性强，灵敏度和准确率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种电化学发光免疫传感器及其检测方法，尤其是涉及一种电位分辨同时检测两种肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用方法，属于免疫传感检测分析
技术介绍
电化学发光免疫传感器是电化学发光和免疫传感器相结合的产物，由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，具有广阔的应用前景，并被广泛应用于临床分析、药物分析和环境检测领域。恶性肿瘤也就是我们所说的癌症，是一类严重威胁人类健康和生命的疾病。肿瘤专家指出，肿瘤的早发现和早诊断是提高肿瘤患者生存率和治愈率的关键。大量资料证实，不同肿瘤既可能具有不同的肿瘤标志物，也可能具有相同的肿瘤标志物，如：癌胚抗原最早发现于结肠癌病人的血清和癌变组织中，随后，在胰腺癌、肝癌病人的血清和癌变组织中也检出癌胚抗原。而同一种肿瘤由于组织类型不同，也有可能有一种或几种肿瘤标志物。在肿瘤标志物的检测过程中，特异性越强，诊断人们患有某种癌症的准确度就越高；灵敏度越高，某种癌症的检出率就高，漏诊的可能性就越小。良好的肿瘤标志物应具有高特异性、高灵敏度和易于检测等特点。然而，大量的临床研究表明，探求一种具有100%的特异性和敏感性且其水平与肿瘤大小、分期及预后相关的理想的肿瘤标志物非常困难。在临床诊断中，常常选择两个或更多特异性较高、可以互补的肿瘤标志物进行联合检测来提高肿瘤检出的准确度和灵敏度。与单种肿瘤标志物检测相比，联合检测还具有缩短分析时间、降低检测成本、提高分析效率等优点。目前，同时检测两种肿瘤标志物的免疫传感器大多采用多通道阵列模式，或者运用两种不同的检测方法，其操作过程繁琐，检测方法复杂，严重影响了检测的时效性。因此，开发灵敏、准确、快速、简便的同时检测两种肿瘤标志物的传感器是迫切需求。目前，检测子宫颈癌的肿瘤标志物鳞状细胞癌抗原（SCCA）和糖类抗原125（CA125）的免疫分析方法主要有：荧光免疫分析法（FIA）、电化学免疫分析法（ECIA）、和电化学发光免疫分析法（ECLIA）等，这些方法都有一定的灵敏度和准确度，但也各有一定的不足之处：有的仪器昂贵、操作复杂、技术要求高，有的步骤繁多、易出现假阳性和假阴性，更重要的是，这些方法大多难以实现灵敏、准确、快速、简便的两种肿瘤标志物的同时检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单，特异性强，灵敏度和准确率高的电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）第一信号单元（anti-CA1252-Ru-NH2@GO-COOH）的制备方法a.取30～50mL2.0～3.0mg/mL的氧化石墨烯（GO）于三颈烧瓶中，加入5～10mL溴化氢（HBr），常温下搅拌12～15h，然后加入1.0～2.0g乙二酸，常温下搅拌4h，于8000rpm离心弃去上清液，然后用蒸馏水洗涤至中性，定容至30～50mL，得到羧基化的氧化石墨烯（GO-COOH）溶液；b.取200μL上述羧基化的氧化石墨烯溶液于1.5mL玻璃瓶中，超声10min，然后加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加0.1～0.2mol/L盐酸溶液至溶液pH为4.0～6.0，振荡孵育1～3h，加入1mL二次水清洗，于8000rpm离心3次去除上清液以去除剩余的偶联试剂后，定容至200～300µL；然后加入50～100µL10-6～10-4U/mLanti-CA1252和50～100µL10-4～10-2mol/L二(2,2-联吡啶)(5-氨基-1,10-邻菲咯啉)合钌(II)（Ru-NH2），用0.1～0.2mol/LNaOH溶液调pH为8.0～10.0，继续振荡孵育3～5h；然后加入50～100µL2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h；再加入蒸馏水离心清洗至中性后，定容至100～200µL，即得到第一信号单元anti-CA1252-Ru-NH2@GO-COOH；（2）第二信号单元（anti-SCCA2-AuNPs/g-C3N4）的制备方法a.氮化碳（g-C3N4）薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5h，真空干燥后，得到氮化碳（g-C3N4）粉末；取0.8～1.5g氮化碳粉末加入到80～120mL4～6mol/LHNO3中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心弃去上清液，然后用蒸馏水洗涤至中性，超声4个小时，8000rpm离心半个小时，取上清液，即得到产物氮化碳薄膜溶液；b.将30～70mL氮化碳薄膜溶液加入到30～70mL胶体金溶液中，室温下搅拌16～24h，然后于6000～8000rpm离心半小时后，去除没有连接上的胶体金，取其上清液即得到AuNPs/g-C3N4溶液；然后取200μLAuNPs/g-C3N4溶液于玻璃瓶中，加入30～50μL10-6～10-4mg/mLanti-SCCA2溶液后孵育3～5h；然后加入50～100µL2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h；加入1mL二次水清洗，于12000rpm离心去除上清液以去除剩余的牛血清白蛋白，即得第二信号单元anti-SCCA2-AuNPs/g-C3N4溶液；（3）电化学发光免疫传感器的组装a.将直径为3～5mm的金电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，用蒸馏水冲洗干净，再依次在乙醇、蒸馏水中超声洗涤，清洗后的电极放入浓H2SO4和H2O2按体积比7:3混合成的混合溶液中浸泡5～10min，取出洗净，然后在0.5mol/L硫酸溶液中用循环伏安扫描处理，扫描速度为50mV/s，电压范围为-0.3～1.5V，持续扫描得到稳定的循环伏安图后，取出用二次蒸馏水洗净待用；b.将上述预处理过的金电极插入20～30µL含10-6～10-4U/mLanti-CA1251和10-6～10-4mg/mLanti-SCCA1的混合溶液中，孵育16h，然后加入50～100µL2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h，用蒸馏水清洗去除剩余的牛血清白蛋白溶液，然后孵育在50～100µL含有CA125和SCCA的待测混合溶液中，于37℃中孵育1～2h后，清洗；再置于10～20µL由步骤（1）b所得的anti-CA1252-Ru-NH2@GO-COOH溶液和步骤（2）b所得的anti-SCCA2-AuNPs/g-C3N4溶液按等体积混合而成的混合溶液，于37℃中孵育1～2h后，清洗；即得到同时检测CA125和SCCA两种肿瘤标志物的电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器。步骤（1）b中所述的偶联试剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）的摩尔浓度为10～100mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔浓度为1～10mmol/L。步骤（2）b中胶体金溶液的制备方法如下：将80～120mL蒸馏水和1～本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）第一信号单元的制备方法a.取30～50 mL 2.0～3.0 mg/mL的氧化石墨烯于三颈烧瓶中，加入5～10 mL溴化氢，常温下搅拌12～15 h，然后加入1.0～2.0 g乙二酸，常温下搅拌4 h，于8000 rpm离心弃去上清液，然后用蒸馏水洗涤至中性，定容至30～50 mL，得到羧基化的氧化石墨烯溶液；b.取200 μL上述羧基化的氧化石墨烯溶液于1.5 mL玻璃瓶中，超声10 min，然后加入200～400 μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加0.1～0.2 mol/L盐酸溶液至溶液pH为4.0～6.0，振荡孵育1～3 h，加入1 mL二次水清洗，于8000 rpm离心3次去除上清液后，定容至200～300 µL；然后加入50～100 µL 10‑6～10‑4 U/mL anti‑CA1252溶液和50～100 µL 10‑4～10‑2 mol/L Ru‑NH2溶液，用0.1～0.2 mol/L NaOH溶液调pH为8.0～10.0，继续振荡孵育3～5 h；然后加入50～100 µL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2 h；再加入蒸馏水离心清洗至中性后，定容至100～200 µL，即得到第一信号单元anti‑CA1252‑ Ru‑NH2@GO‑COOH溶液；（2）第二信号单元的制备方法a．氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600 ℃下加热3～5 h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 mol/L HNO3中，于120～150 ℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000 rpm离心弃去上清液，然后用蒸馏水洗涤至中性，超声4个小时，8000 rpm离心半个小时，取上清液，即得到产物氮化碳薄膜溶液；b．将30～70 mL氮化碳薄膜溶液加入到 30～70 mL 胶体金溶液中，室温下搅拌16～24 h，然后于6000～8000 rpm离心半小时后，去除没有连接上的胶体金，取其上清液即得到AuNPs/g‑C3N4溶液；然后取200 μL AuNPs/g‑C3N4溶液于玻璃瓶中，加入30～50 μL 10‑4～10‑6 mg/mL anti‑SCCA2溶液后孵育3～5 h；然后加入50～100 µL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2 h；加入1 mL二次水清洗，于12000 rpm离心去除上清液后，即得第二信号单元anti‑SCCA2‑AuNPs/g‑C3N4溶液；（3）电化学发光免疫传感器的组装a. 将直径为3～5 mm的金电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，用蒸馏水冲洗干净，再依次在乙醇、蒸馏水中超声洗涤，清洗后的电极放入浓H2SO4和H2O2按体积比7:3混合成的混合溶液中浸泡5～10 min，取出洗净，然后在0.5 mol/L 硫酸溶液中用循环伏安扫描处理，扫描速度为50 mV/s，电压范围为‑0.3～1.5 V，持续扫描得到稳定的循环伏安图后，取出用二次蒸馏水洗净待用；b. 将上述预处理过的金电极插入20～30 µL 含10‑6～10‑4 U/mL anti‑CA1251和10‑6～10‑4 mg/mL anti‑SCCA1的混合溶液中，孵育16 h，然后加入50～100 µL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2 h，用蒸馏水清洗去除剩余的牛血清白蛋白溶液，然后孵育在50～100 µL含有CA125和SCCA的待测混合溶液中，置37 ℃中孵育1～2 h后，清洗；再置于10～20 µL由步骤（1）b所得的anti‑CA1252‑Ru‑NH2@GO‑COOH溶液和步骤（2）b所得的anti‑SCCA2‑AuNPs/g‑C3N4溶液按等体积混合而成的混合溶液中，于37 ℃中孵育1～2 h后，清洗；即得到同时检测CA125和SCCA两种肿瘤标志物的电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器。...
【技术特征摘要】
1.一种电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）第一信号单元的制备方法a.取30～50mL2.0～3.0mg/mL的氧化石墨烯于三颈烧瓶中，加入5～10mL溴化氢，常温下搅拌12～15h，然后加入1.0～2.0g乙二酸，常温下搅拌4h，于8000rpm离心弃去上清液，然后用蒸馏水洗涤至中性，定容至30～50mL，得到羧基化的氧化石墨烯溶液；b.取200μL上述羧基化的氧化石墨烯溶液于1.5mL玻璃瓶中，超声10min，然后加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加0.1～0.2mol/L盐酸溶液至溶液pH为4.0～6.0，振荡孵育1～3h，加入1mL二次水清洗，于8000rpm离心3次去除上清液后，定容至200～300µL；然后加入50～100µL10-6～10-4U/mLanti-CA1252溶液和50～100µL10-4～10-2mol/LRu-NH2溶液，用0.1～0.2mol/LNaOH溶液调pH为8.0～10.0，继续振荡孵育3～5h；然后加入50～100µL2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h；再加入蒸馏水离心清洗至中性后，定容至100～200µL，即得到第一信号单元anti-CA1252-Ru-NH2@GO-COOH溶液；（2）第二信号单元的制备方法a．氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5g氮化碳粉末加入到80～120mL4～6mol/LHNO3中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心弃去上清液，然后用蒸馏水洗涤至中性，超声4个小时，8000rpm离心半个小时，取上清液，即得到产物氮化碳薄膜溶液；b．将30～70mL氮化碳薄膜溶液加入到30～70mL胶体金溶液中，室温下搅拌16～24h，然后于6000～8000rpm离心半小时后，去除没有连接上的胶体金，取其上清液即得到AuNPs/g-C3N4溶液；然后取200μLAuNPs/g-C3N4溶液于玻璃瓶中，加入30～50μL10-4～10-6mg/mLanti-SCCA2溶液后孵育3～5h；然后加入50～100µL2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h；加入1mL二次水清洗，于12000rpm离心去除上清液后，即得第二信号单元anti-SCCA2-AuNPs/g-C3N4溶液；（3）电化学发光免疫传感器的组装a.将直径为3～5mm的金电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，用蒸馏水冲洗干净，再依次在乙醇、蒸馏水中超声洗涤，清洗后的电极放入浓H2SO4和H2O2按体积比7:3混合成的混合溶液中浸泡5～10min，取出洗净，然后在0.5mol/L硫酸溶液中用循环伏安扫描处理，扫描速度为50mV/s，电压范围为-0.3～1.5V，持续扫描得到稳定的循环伏安图后，取出用二次蒸馏水洗净待用；b.将上述预处理过的金电极插入20～30µL含10-6～...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭智勇，武琳，胡宇芳，俞欣辰，郭富米，吴雁捷，曾敏，于中晴，陶莹莹，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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