本发明专利技术公开了一种恶臭假单胞菌ZJPH1412及其制备(S)‑3‑羟基金刚烷甘氨酸的应用，采用该新菌种催化制备光学纯(S)‑3‑羟基金刚烷甘氨酸具有立体选择性好，产物光学纯度高等优点；本发明专利技术通过采用恶臭假单胞菌ZJPH1412经发酵获得的湿菌体为催化剂的手性生物催化，当底物浓度为20mmol/L时，目的产物(S)‑3‑羟基金刚烷甘氨酸的ee达到99.9％，产率达到77.3％。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一株微生物新菌种—恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZJPH1412，以及在催化2-(3-羟基-1-金刚烷)-2-氧代乙酸不对称转氨制备(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸中的应用。(二)
技术介绍
(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸的化学结构式为：(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸是用于合成治疗2型糖尿病DPP-4抑制剂药物沙格列汀的重要手性中间体。沙格列汀是一种高效、选择性、可逆性的DPP-4抑制剂。2013年美国临床内分泌医师学会推出的糖尿病治疗方案最新指南中将DPP-4抑制剂作为2型糖尿病单药和联合治疗的首选药物之一。相比于其他DPP-4抑制剂，在相同抑制浓度为1.3nmol/LDPP-4时沙格列汀的作用约是维格列汀或西他列汀的十倍。其主要代谢产物5-羟沙格列汀也是一个选择性DPP-4抑制剂，其活性为沙格列汀的50％。目前催化2-(3-羟基-1-金刚烷)-2-氧代乙酸制备光学纯的(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸的方法主要有化学法和生物法。采用化学法合成时，需要使用金属雷尼镍催化剂，且步骤繁琐，污染大，产率偏低。生物法则是利用游离酶或全细胞来催化制备。可用于制备(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸的酶主要有苯丙氨酸脱氢酶或支链转氨酶，苯丙氨酸脱氢酶在催化还原氨化反应过程中需要添加甲酸铵、二硫苏糖醇、辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，但辅酶价格昂贵，且苯丙氨酸脱氢酶的分离纯化步骤复杂，增加了该药物的制备成本。利用支链转氨酶可一步实现氨化反应，但由于存在副产物抑制，以及反应时所发生的平衡逆向移动的限制，工业化应用存在一定的问题。利用全细胞催化法制备可省去复杂的酶分离纯化过程。目前文献报道的生物催化合成(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸主要涉及以下几种微生物或酶。RonaldL.Hanson等(HansonRL,GoldbergSL,BrzozowskiDB,etal.,Adv.Synth.Catal.,2007,349(8-9):1369-1378)从中间型嗜热放线菌(Thermoactinomycesintermedius)中克隆表达苯丙氨酸脱氢酶基因，经修饰后，转入毕赤酵母中表达。该重组毕赤酵母在甲醇存在下生长并产生一种内源性甲酸脱氢酶，该酶可用于辅酶NAD(H)的再生。从毕赤酵母中提取修饰型的苯丙氨酸脱氢酶和内源性甲酸脱氢酶两种纯酶作为生物催化剂，添加甲酸铵、二硫苏糖醇、辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，以2-(3-羟基-1-金刚烷)-2-氧代乙酸为底物直接还原氨化可制得(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸，ee值大于99％，转化率大于80％，但该转化过程需提取并利用两种酶催化制备得到产物；EunyoungHong等(HongEY,ChaM,YunH,etal.,J.Mol.Catal.B:Enzym,2010,66(1-2):228-233)从大肠杆菌(Escherichiacoli)K12中分别克隆表达支链转氨酶基因和天冬氨酸转氨酶基因获得两种重组工程菌，并利用这两种工程菌全细胞催化制备(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸，产率达90.5％，光学活性大于99％；Ju-YeonKim等(KimJ-Y,LeeY-A,WittmannC,etal.,Biotechnol.Bioeng.,2013,110(11):2846-2855)从大肠杆菌(Escherichiacoli)K12中克隆表达支链转氨酶基因，以野生型谷氨酸棒状杆菌(CorynebacteriumGlutamicum)为宿主获得重组工程菌，并利用该重组工程菌进行全细胞催化合成L-HAG，反应80h后，转化率为80％。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株微生物新菌种—恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZJPH1412，以及在不对称催化2-(3-羟基-1-金刚烷)-2-氧代乙酸转氨制备(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株—恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZJPH1412，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号：CCTCCNO：M2016187，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。此外，本专利技术还提供一种所述恶臭假单胞菌ZJPH1412在(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸制备中的应用，所述的应用为：以2-(3-羟基-1-金刚烷)-2-氧代乙酸为底物，L-谷氨酸为氨基供体，以恶臭假单胞菌ZJPH1412经发酵培养获得的湿菌体为酶源，于pH为9.0的Tris-HCl缓冲液中构成转化体系，在30-45℃(优选40℃)条件下进行反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液，得到含产物(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸的转化液。所述底物的初始加入终浓度为10～50mmol/L缓冲液(优选20mmol/L)，氨基供体浓度为底物初始浓度的2倍(即终浓度为20～100mmol/L缓冲液)，湿菌体的用量以菌体湿重计为50～350g/L缓冲液(优选300g/L)。进一步，优选所述反应是在40℃条件下转化反应2～50h，优选30～42h。为更进一步提高产率，所述转化体系中还添加支链转氨酶的辅酶即PLP辅酶。所述辅酶加入终浓度为0.01～0.1mmol/L缓冲液(优选0.02mmol/L)。支链转氨酶是PLP(磷酸吡哆醛)辅酶依赖型的酶，在体系中额外添加辅酶PLP有利于转氨反应的进行。更进一步，优选所述恶臭假单胞菌ZJPH1412在制备(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸中的应用按如下步骤进行：以2-(3-羟基-1-金刚烷)-2-氧代乙酸为底物，L-谷氨酸为氨基供体，以恶臭假单胞菌ZJPH1412经发酵培养获得的湿菌体为酶源，加入辅酶，于pH为9.0的Tris-HCl缓冲液中构成转化体系，在40℃条件下反应42h，反应结束后，获得含有目标产物的转化液；所述底物的初始加入终浓度为20mmol/L缓冲液，L-谷氨酸浓度为40mmol/L缓冲液，湿菌体的用量以菌体湿重计为300g/L缓冲液；所述优选辅酶PLP，在转化体系中的添加终浓度为0.02mmol/L缓冲液。本专利技术所述酶源按如下方法获得：1)斜面培养：挑取恶臭假单胞菌ZJPH1412单菌落接种至斜面培养基，37℃培养1d，4℃冰箱保存；斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH6.5～7.0；2)种子培养：从培养成熟的斜面挑一环菌体接入种子培养基中，37℃，200rpm培养16h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，溶剂为水，pH6.5～7.0；3)发酵培养：以体积浓度10％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，37℃，200rpm培养20h，获得发酵液，将发酵液离心，所得沉淀用pH8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液洗涤，获得湿菌体，即为酶源；所述发酵培养基终浓度组成为：30g/L麦芽糖，40.04g/L玉米浆干粉，49.83g/L牛肉膏，0.4g/LMgSO4·7H2O，0.11g/LLi2SO4·H2O，溶剂为水，pH6.5～7.0。与现有技术相比，本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJPH1412，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号：CCTCC NO：M 2016187，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
【技术特征摘要】
1.恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZJPH1412，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号：CCTCCNO：M2016187，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述恶臭假单胞菌ZJPH1412在制备(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以2-(3-羟基-1-金刚烷)-2-氧代乙酸为底物，L-谷氨酸为氨基供体，以恶臭假单胞菌ZJPH1412经发酵培养获得的湿菌体为酶源，于pH为8.5-9.5的Tris-HCl缓冲液中构成转化体系，在30-45℃条件下进行转化，反应结束后，将转化液离心，取上清液，得到含产物(S)-3-羟基金刚烷甘氨酸的转化液。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的初始加入终浓度为10～50mmol/L缓冲液，氨基供体终浓度为20～100mmol/L缓冲液，湿菌体的用量以菌体湿重计为50～350g/L缓冲液。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中还添加有磷酸吡哆醛。6.如权利要求5所述的应用，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：王普，陈亭亭，牛婷婷，孟凡婷，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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