本发明专利技术提供了一种带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶的制备方法，是构建表达带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的工程菌，进行发酵培养得到菌体，然后破碎细胞获得带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的上清液，再用离子交换树脂吸附酶，得到带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶。利用这种方法固定化酶，无需对酶进行分离纯化，可以根据调节pH值的大小改变酶蛋白的带电量，并利用酶分子连接的带电荷的寡聚氨基酸侧链与离子交换树脂之间的电荷吸附作用将酶蛋白固定在树脂上，操作简单，并且酶与载体之间的结合力强不易脱落，可以反复多次使用，在降低成本的基础上可用于连续生产或在反应器中进行搅拌反应，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法。
技术介绍
D-阿洛酮糖的能值为0.007kcal/g，被称为无能量的甜味剂；可抑制肠道α-葡萄糖苷酶活性，防止血糖升高，作为Ⅱ型糖尿病人的辅助治疗剂；可减小脂肪合成酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积，降低血脂，并可预防肥胖；对神经具有保护作用。鉴于D-阿洛酮糖良好的性质，美国食品及药品管理局于2011年对D-阿洛酮糖的安全性进行确认，并正式批准其为GRAS食品，允许应用于食品和膳食补充剂以及医药制剂中，开发应用前景极为广阔。但是，其在自然界中的含量极少，不易从自然界中提取，并且化学合成的方法副产物多、不易纯化；而生物催化法的研究目前主要停留在实验室水平，尚无大规模生产的报道；现阶段的研究无法满足D-阿洛酮糖在食品和膳食补充剂以及医药制剂中的应用，虽然阿洛酮糖的市场需求日益增加，但高昂的价格限制了它们的市场规模和应用。因此，从各方面大幅降低生产成本，实现规模化生产变得极其重要。水溶性的酶不易从反应系统中分离出来，不利于控制和自动化生产；利用物理或化学的方法使酶与大分子载体结合，使酶固定化在机械性能好的颗粒上，可以增加酶的稳定性，能反复多次使用，在降低成本的基础上可以用于连续生产或在反应器中进行搅拌反应；所以，固定化的转化D-果糖生成D-阿洛酮糖的酶是D-阿洛酮糖大规模工业生产中的重要条件。但是，传统的酶的固定化方法涉及酶的分离纯化，制备步骤复杂，成本高。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种简单、高效和低成本的带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法。本专利技术所述的带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法，步骤是：(1)构建表达带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌；(2)按1％的接种量将步骤(1)的工程菌接种于LB培养基中，在37℃，200rpm条件发酵培养2～4h，当OD值达到0.6后，用终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，200rpm诱导过夜，然后再于4℃，8000rpm离心收集菌体，并用pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再4℃，8000rpm离心收集得到菌体；(3)按每1g菌体中加入10mL磷酸盐缓冲液的比例向获得的菌体中加入pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液，利用细胞破碎仪破碎15±5min后，在4℃，8000rpm条件离心，收集带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的上清液；(4)在带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的上清液中按比例加入离子交换树脂，在4℃，120rpm条件吸附固定化10±3h，得到吸附有带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的树脂；(5)用pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤制备的树脂3～5次，以洗去游离的酶液，得到带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，4℃保存，备用；其特征在于：步骤(1)所述构建表达带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶工程菌的方法是：①以报道的D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列(核苷酸序列如SEQIDNo.1所示)为模板，设计引物，进行PCR克隆反应，获得带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因序列；其中相关引物的核苷酸序列是：DPE-12-NdeI上游：5’-GGGAATTCCATATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3’；DPE-12-XhoI下游：5’-CCGCTCGAGTCAATCTTCGTCCTCATCTTCGTCCTCATCTTCGTCGTCGACTTCAAATACATGTT-3’；②获得的带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因命名为DPE-12，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，利用DNA纯化回收试剂盒对目的基因产物进行回收；③用限制性内切酶NdeI和XhoI分别对回收的目的基因产物和质粒载体pET22b进行双酶切，利用DNA纯化回收试剂盒分别回收酶切后的DPE-12和质粒片段，然后利用T4连接试剂盒将DPE-12和质粒片段进行连接；④将③中的连接液转化大肠杆菌E.coliDH5α，利用Amp-LB平板筛选，获得的阳性克隆进行测序分析，测序无误的阳性克隆扩大培养，提取质粒，命名为表达质粒pET22b-DPE-12；⑤将表达质粒pET22b-DPE-12转化大肠杆菌BL21，利用Amp-LB平板筛选获得阳性转化子，验证无误的阳性转化子命名为BL21-pET22b-DPE-12，即获得表达带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌；步骤(4)所述离子交换树脂为碱性阴离子交换树脂；其加入量是按1mL酶上清液加1g树脂的比例在带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的上清液中加入离子交换树脂。本专利技术所述的带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶是由D-阿洛酮糖3-差向异构酶的C端添加了含12个聚谷氨酸和天冬氨酸的带电荷的寡聚氨基酸侧链组成，所述带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶与普通D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，在相同pH值条件下，|pI-pH|更大，蛋白带的电荷更多，与离子交换树脂的吸附更牢固。利用这种方法固定化酶，无需对酶进行分离纯化，可以根据调节pH值的大小改变酶蛋白的带电量，并利用酶分子连接的带电荷的寡聚氨基酸侧链与离子交换树脂之间的电荷吸附作用将酶蛋白固定在树脂上，操作简单，并且酶与载体之间的结合力强不易脱落。通过本专利技术方法得到的固定化酶，稳定性增加，并可以反复多次使用，在降低成本的基础上可用于连续生产或在反应器中进行搅拌反应，应用前景广阔。附图说明图1是带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因改造质粒构建图。图2是BL21-pET22b-DPE-12转化子发酵上清液的SDS-PAGE结果图；其中：泳道1为BL21-pET22b空白对照；泳道2为BL21-pET22b-DPE-12-未诱导；泳道3为BL21-pET22b-DPE-12-全蛋白；泳道4为BL21-pET22b-DPE-12-破碎沉淀；泳道5为BL21-pET22b-DPE-12-破碎蛋白上清液。图3是固定化酶重复利用效果图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例，对本专利技术作进一步说明。实施例1构建表达带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌(1)以已报道的D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列(核苷酸序列如SEQIDNo.1所示)为模板，设计引物，进行PCR克隆反应，获得带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因序列；其中设计的引物的核苷酸序列是：DPE-12-NdeI上游：GGGAATTCCATATGAAATATGGTATTTATTACGCT(划线部分为NdeI酶切位点)；DPE-12-XhoI下游：CCGCTCGAGTCAATCTTCGTCCTCATCTTCGTCCTCATCTTCGTCGTCGACTTCAAATACATGTT(划线部分为XhoI酶切位点)，PCR扩增条件：预变性94℃2min；98℃10sec；退火59℃15sec；延伸72℃1min；30个循环；72℃延伸10min；12℃保温；(2)获得的带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因命名为DPE-12，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。利用DNA纯化回收试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)对目的基因产物进行回收，具体操作本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶的制备方法，步骤是：(1)构建表达带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的工程菌；(2)按1％的接种量将步骤(1)的工程菌接种于LB培养基中，在37℃，200rpm条件发酵培养2～4h，当OD值达到0.6后，用终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，200rpm诱导过夜，然后再于4℃，8000rpm离心收集菌体，并用pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再4℃，8000rpm离心收集得到菌体；(3)按每1g菌体中加入10mL磷酸盐缓冲液的比例向获得的菌体中加入pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液，利用细胞破碎仪破碎15±5min后，在4℃，8000rpm条件离心，收集带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的上清液；(4)在带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的上清液中按比例加入离子交换树脂，在4℃，120rpm条件吸附固定化10±3h，得到吸附有带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的树脂；(5)用pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤制备的树脂3～5次，以洗去游离的酶液，得到带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶，4℃保存，备用；其特征在于：步骤(1)所述构建表达带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶工程菌的方法是：①以报道的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶核苷酸序列为模板，设计引物，进行PCR克隆反应，获得带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因序列；其中相关引物的核苷酸序列是：DPE‑12‑NdeI上游：5’‑GGGAATTCCATATGAAATATGGTATTTATTACGCT‑3’；DPE‑12‑XhoI下游：5’‑CCGCTCGAGTCAATCTTCGTCCTCATCTTCGTCCTCATCTTCGTCGTCGACTTCAAATACATGTT‑3’；②获得的带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因命名为DPE‑12，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，利用DNA纯化回收试剂盒对目的基因产物进行回收；③用限制性内切酶NdeI和XhoI分别对回收的目的基因产物和质粒载体pET22b进行双酶切，利用DNA纯化回收试剂盒分别回收酶切后的DPE‑12和质粒片段，然后利用T4连接试剂盒将DPE‑12和质粒片段进行连接；④将③中的连接液转化大肠杆菌E.coli DH5α，利用Amp‑LB平板筛选，获得的阳性克隆进行测序分析，测序无误的阳性克隆扩大培养，提取质粒，命名为表达质粒pET22b‑DPE‑12；⑤将表达质粒pET22b‑DPE‑12转化大肠杆菌BL21，利用Amp‑LB平板筛选获得阳性转化子，验证无误的阳性转化子命名为BL21‑pET22b‑DPE‑12，即获得表达带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的工程菌；步骤(4)所述离子交换树脂为碱性阴离子交换树脂；其加入量是按1mL酶上清液加1g树脂的比例在带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的上清液中加入离子交换树脂。...
【技术特征摘要】
1.一种带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法，步骤是：(1)构建表达带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌；(2)按1％的接种量将步骤(1)的工程菌接种于LB培养基中，在37℃，200rpm条件发酵培养2～4h，当OD值达到0.6后，用终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，200rpm诱导过夜，然后再于4℃，8000rpm离心收集菌体，并用pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再4℃，8000rpm离心收集得到菌体；(3)按每1g菌体中加入10mL磷酸盐缓冲液的比例向获得的菌体中加入pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液，利用细胞破碎仪破碎15±5min后，在4℃，8000rpm条件离心，收集带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的上清液；(4)在带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的上清液中按比例加入离子交换树脂，在4℃，120rpm条件吸附固定化10±3h，得到吸附有带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的树脂；(5)用pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤制备的树脂3～5次，以洗去游离的酶液，得到带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，4℃保存，备用；其特征在于：步骤(1)所述构建表达带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶工程菌的方法是：①以报道的D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列为模板，设计引物，进行PCR克隆反应，获得带侧链的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因序列；其中相关引物的核苷酸序列是：DPE-12-NdeI上游：5’-GGGAATTCCATATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3’；DPE-12-XhoI下游：5’-CCGCTCGAGTCAA...
【专利技术属性】
技术研发人员：林建强，李灿，林建群，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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