一种生物适配体传感器的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种生物适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：制备缓冲溶液；合成ZnS纳米簇，制备适配体1修饰ZnS纳米簇；合成Fe3O4纳米粒子，制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子；制备适配体2修饰电极；加入血小板衍生生长因子‑BB，构建生物传感器。本发明专利技术采用应用广泛的便携式血糖仪结合适配体构建生物传感器，旨在为快速、定量通过转换出的葡萄糖含量为间接检测血小板衍生生长因子提供一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物传感器
，具体涉及一种生物适配体传感器的制备方法及检测血小板衍生生长因子-BB的方法，可以实现对血小板衍生生长因子-BB的灵敏检测。
技术介绍
血小板衍生生长因子是血管内皮生长因子家族的一种含有糖链的多肽生长因子，具有较好的热稳定性，耐热度可达100℃，等电点为9.8，其相对分子量为30kD左右。血小板衍生生长因子存在至少三种异构体；血小板衍生生长因子-AA，血小板衍生生长因子-AB和血小板衍生生长因子－BB，其中PDGF-AA和血小板衍生生长因子为同型二聚体，PDGF-AB为异型二聚体。血小板衍生生长因子无论是在正常生理还是病理状态下都起着重要的作用。在正常生理状态下，血小板衍生生长因子能够促进多种间质细胞(如肾小球血管细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞等)的趋化、分裂和增殖，并且对机体的生长发育有着重要的作用。但是，血小板衍生生长因子的异常表达及其受体的过度激活可诱导形成肿瘤新生血管而直接或间接地促进肿瘤细胞的增殖与迁移。其中，血小板衍生生长因子-BB与肿瘤细胞的生长与转化有直接的关系，在肿癌细胞中会过度表达。因此，它是一种重要的肿瘤标记物，对于癌症的诊断、治疗及预后有着重要的意义，检测血小板衍生生长因子-BB具有重要的科研价值。近年来由于核酸适配体的发展及其相对于抗体的诸多优势，采用适配体为识别原件的生物传感器检测蛋白质得到了广泛的应用。核酸适配体是通过一种体外筛选技术—指数富集配体系统进化技术筛选出来的一种能与蛋白质和小分子物质特异性结合的单链DNA或RNA寡核苷酸片段，一般由25-80个碱基组成。适配体具有高特异性和亲和力，且目标分子范围广，不仅可与大分子(如核酸、蛋白质、多肽等)结合，也能与小分子(如氨基酸、金属离子等)结合，甚至还可与整个细胞结合。这就表明适配体为识别元件可明显地拓宽相关传感器的应用范围。适配体比抗体更容易修饰，而且可以在适配体的精确位点进行修饰，并且不影响其亲和力，如修饰一些电化学探针、荧光基团和猝灭基团等，这就使得生物传感器的构建更加方便。近年来，随着对核酸适配体的进一步了解，基于适配体的生物传感器的发展及应用得到了广泛地关注，并且构建了一系列基于适配体的生物传感器用于蛋白质的检测、小分子的检测、药物分析、环境监测，食品检测等领域。生物传感技术的发展与进步大大的推动了电分析化学在生物化学领域中的应用。然而电化学方法仪器较为笨重，因而应用一种便携式的检测设备成为分析化学新的发展方展。血糖仪是一种测量血糖水平的电子仪器。由于其体积小、成本低、操作简单，能够得到准确的定量结果，在生活中已经得到了广泛应用，改善了糖尿病患者的生活质量。然而，血糖仪只能检测葡萄糖这一种物质，并且检测范围是0.6～33mmol/L(10～600mg/dL)。目前利用血糖仪结合抗体或DNA定量检测非葡萄糖物质的方法已有报道，如运用血糖仪结合功能性DNA传感器定量检测多种目标分子，使用商业化的个人血糖仪便携式定量DNA分子，采用侵入式DNA方法结合血糖仪便携式定量检测金属离子。在实际检测中，目标物往往含量极低，而采用常规的生物传感技术来检测这些浓度极低的物质时，很难达到检测的目的。
技术实现思路
针对以上现有技术问题，本专利技术的目的在于提供一种生物适配体传感器的制备方法，以DNA可组装、可折叠性质为基础，使用血糖仪作为检测仪器快速便捷的检测目标物质，利用阳离子交换释放出Zn2+进行DNA酶剪切循环从而进行信号放大提高实验的灵敏度，构建信号放大的适配体生物传感器，构建灵敏、快速的检测血小板衍生生长因子-BB方法。一种生物适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)制备缓冲溶液；(2)合成ZnS纳米簇，制备适配体1修饰ZnS纳米簇；(3)合成Fe3O4纳米粒子，制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子；(4)制备适配体2修饰电极；(5)加入血小板衍生生长因子-BB，构建生物传感器。进一步地，步骤(1)中所述缓冲溶液包括实验体系所用缓冲溶液和/或DNA缓冲溶液。进一步地，步骤(1)包括以下步骤：将分别为2.5OD的适配体1、适配体2，探针DNA，8-17DNA酶序列分别溶解在20mMpH＝7.4PBS缓冲溶液中，分别得到多个浓度为100μM的DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用。进一步地，DNA序列分别为：进一步地，步骤(2)中采用水热法合成ZnS纳米簇，包括如下步骤：(2-1)将0.1756g的二水合醋酸锌和1.5224g的硫脲溶解在20mL的超纯水中形成澄清溶液；(2-2)室温下搅拌30分钟；(2-3)装入反应釜中140℃加热90分钟；(2-4)冷却至室温后，离心得到白色沉淀物质；(2-5)20mL超纯水洗两遍20mL乙醇洗两遍后60℃烘干6小时得到ZnS纳米簇。进一步地，步骤(2)中制备适配体1修饰ZnS纳米簇，包括如下步骤：(2-6)将1mg的ZnS纳米簇溶解于1mL的PBS缓冲溶液中；(2-7)25μL1mg/mL的链霉亲和素6mgof1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解于1mLPBS缓冲溶液中；(2-8)震荡15分钟；(2-9)加入20μL1mg/mL的ZnS纳米簇；(2-10)室温震荡3小时得到链霉亲和素修饰的ZnS纳米簇溶液；(2-11)适配体1加入上述溶液中，实现适配体1终浓度5μM；(2-12)室温下搅拌30分钟合成适配体1修饰ZnS纳米簇。进一步地，步骤(3)合成Fe3O4纳米粒子包括如下步骤：(3-1)1.35g的六水合三氯化铁溶解于40mL乙二醇中形成澄清溶液；(3-2)加入3.6g醋酸钠和1.0g聚乙二醇；(3-3)混合物搅拌30分钟后倒入反应釜中；(3-4)200℃加热8小时；(3-5)冷却至室温；(3-6)用乙醇和水清洗；(3-7)60℃烘干6小时后得到Fe3O4纳米粒子。进一步地，步骤(4)包括如下步骤：(4-1)在100μL的100μM适配体2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中；(4-2)室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键；(4-3)用PBS缓冲溶液将以上得到的适配体2稀释到0.5μM；(4-4)将5μL0.5μM的适配体2滴加到干净的金电极表面；(4-5)在黑暗环境下室温反应2小时；(4-6)用超纯水清洗；(4-7)将适配体2修饰的金电极保存在含有1.0mM6-巯基乙醇的20mMPBS以封闭剩余的空穴。进一步地，步骤(4-7)中PBS的pH＝7.4。进一步地，步骤(5)包括如下步骤：(5-1)将电极浸入到1.0×10-12M血小板衍生生长因子-BB溶液中；(5-2)将电极浸没在200μL含有14μL1.0mMAgNO3的PBS缓冲溶液中；(5-3)室温下反应10分钟；(5-4)在上述溶液中加入150nM底物DNA，75nM8-17DNAzyme在37℃反应60分钟；(5-5)底物DNA被剪切，通过磁性分离，可得到剪切后的部分底物DNA连接转换酶；(5-6)20μL1.0M的蔗糖溶液加入到分离得到的上述溶液中；(5-7)在室温下反应20分钟。与目前现有技术相比，本专利技术采用应用广泛的便携式血糖仪结合适配体构建生物传感器，旨在为快速、定量通过转换出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备缓冲溶液；(2)合成ZnS纳米簇，制备适配体1修饰ZnS纳米簇；(3)合成Fe3O4纳米粒子，制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子；(4)制备适配体2修饰电极；(5)加入血小板衍生生长因子‑BB，构建生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备缓冲溶液；(2)合成ZnS纳米簇，制备适配体1修饰ZnS纳米簇；(3)合成Fe3O4纳米粒子，制备探针DNA修饰Fe3O4纳米粒子；(4)制备适配体2修饰电极；(5)加入血小板衍生生长因子-BB，构建生物传感器。2.如权利要求1所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述缓冲溶液包括实验体系所用缓冲溶液和/或DNA缓冲溶液。3.如权利要求1和2所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：将分别为2.5OD的适配体1、适配体2，探针DNA，8-17DNA酶序列分别溶解在20mMpH＝7.4PBS缓冲溶液中，分别得到多个浓度为100μM的DNA缓冲溶液，在4℃下保存备用。4.如权利要求3所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，DNA序列分别为：适配体1:CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGTTTTTT-biotin；适配体2:CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGTTTT-(CH2)3-HS；底物DNA：biotin–CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG-(CH2)3-SH；8-17DNA酶：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT。5.如权利要求1-4所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中采用水热法合成ZnS纳米簇，包括如下步骤：(2-1)将0.1756g的二水合醋酸锌和1.5224g的硫脲溶解在20mL的超纯水中形成澄清溶液；(2-2)室温下搅拌30分钟；(2-3)装入反应釜中140℃加热90分钟；(2-4)冷却至室温后，离心得到白色沉淀物质；(2-5)20mL超纯水洗两遍20mL乙醇洗两遍后60℃烘干6小时得到ZnS纳米簇。6.如权利要求1-5所述的生物适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中制备适配体1修饰ZnS纳米簇，包括如下步骤：(2-6)将1mg的ZnS纳米簇溶解于1mL的PBS缓冲溶液中；(2-7)25μL1mg/mL的链霉亲和素6mgof1-(3-二甲氨基丙基)-3-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广凤，洪璐，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34