一种活体在线检测植物赤霉素的微电极生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微电极生物传感技术，具体公开了一种活体在线检测植物赤霉素(GAs)的微电极生物传感器。本发明专利技术通过在工作电极电沉积Au/Ag核‑壳结构复合纳米粒子后，再电聚合L‑Cys/GA3分子印迹聚合物，冲洗后获得分子印迹敏感膜，保证检测的灵敏度和特异性。本发明专利技术通过对活体植物体内GAs的在线监测，原位实时的掌握植物体内GAs的动态变化信息，为了解GAs参与植物生命体系的调控机理提供理论依据。应用本发明专利技术的微电极生物传感器可实现对植物活体内GAs的在线监测，对被检测样本不造成本质伤害；得到的数据结果可实时动态的反映植物体内GAs的含量变化，实际应用操作简便，易于掌握。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微电极生物传感技术，具体地说，涉及一种活体在线检测植物赤霉素的微电极生物传感器及其应用。
技术介绍
赤霉素(GAs)是调节植物生长发育不可缺少的植物激素之一,调控种子萌发、下胚轴伸长、叶片伸展、花、果实及种子发育等众多生理过程，其通过GA-GID1-DELLA复合物,尤其是DELLA蛋白与多种植物激素发生相互作用，对植物正常生长发育起着重要作用。当前，在植物生理学研究中，传统的GAs检测多采用光化学诱导荧光法、高效液相色谱法(HPLC)、色谱－质谱联用技术等离体静态分析方法。这类方法需要对植物材料离体取样，通过检测浸提液中GAs浓度来推测植株体内的含量，所以需对样品进行复杂的前处理，耗时长同时对样品提取纯度要求较高，并且这种离体检测反应的只是植物体内某一时刻的静态浓度或累积效应，无法对植物进行长时间实时动态分析。而随着研究的深入，研究者们希望获得植物体在生长发育过程及环境适应过程中植物激素的实时动态信息，从而更好的指导农业生产。所以对植物活体组织GAs的原位动态检测显得尤为重要。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种活体在线检测植物赤霉素的微电极生物传感器及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供的一种活体在线检测植物赤霉素的微电极生物传感器具有三电极体系，包括Ag/AgCl的参比电极，铂对电极，金工作电极，所述金工作电极上电沉积Au/Ag核-壳结构复合纳米粒子溶胶后，再电聚合L-Cys/GA3分子印迹聚合物。所述Au/Ag核-壳结构复合纳米粒子溶胶的制备方法为：将100mL1.0×10-3-5×10-3mol·L-1的HAuCl4溶液加热至沸，向沸液中一次性加入9.34mL0.0378-0.5mol·L-1的Na2C6H5O7溶液，保持沸腾15-30min，自然冷却；取10mL通过上述方法制得的金溶胶稀释至100mL加热至沸，向沸液中一次性加入1mL0.0378-0.5mol·L-1的Na2C6H5O7溶液，再沸；向沸液中分批加入5mL1×10-2-5×10-2mol·L-1的AgNO3溶液，保持沸腾1-1.5h，自然冷却。所述L-Cys/GA3分子印迹聚合物的制备方法为：将0.007gGA3加入到100ml蒸馏水中，制备2.0×10-4MGA3原液；将0.0024gL-Cys加入到1.0MNaOH溶液中，用0.04M的PBS溶液稀释至100ml，制备2.0×10-4ML-Cys原液；将L-Cys和GA3的原液以2：1-4:1的体积混合，制备分子印迹聚合物溶液。进一步地，本专利技术提供的活体在线检测植物赤霉素的微电极生物传感器的金工作电极的制备方法包括以下步骤：首先微电极阵列通过微机电加工技术(MEMS)制备，包括Ag/AgCl的参比电极，铂对电极及金工作电极，其中裸露导电部分长约5-20mm；将微电极置于0.5M稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描(-0.2～1.6V)得到典型的循环伏安谱图，确保电极表面清洁；在金工作电极上电沉积Au/Ag核-壳结构复合纳米粒子溶胶进行修饰，20-40分钟后(优选30分钟)，用前述修饰过的金工作电极以L-Cys/CA3分子印迹聚合物溶液为电解质溶液，用循环伏安法扫描进行电聚合，然后用甲醇乙酸溶液冲洗。进一步地，循环伏安法扫描进行电聚合的工作条件为，电压0V-1.2V，20-100mV/s(优选50mV/s)，扫描15-60圈(优选30圈)。优选地，电压0V-1.2V，50mV/s，扫描30圈。所述甲醇乙酸溶液的体积比为5:1-8:1(优选8:1)，冲洗时间为5分钟。为了能够实现活体检测植物组织中的赤霉素，采样中把对植物组织的伤害降低到最小，本专利技术的微电极生物传感器的电极外观具有穿透植物组织的能力，如图1所示的外观，裸露导电部位长度为5-20mm。本专利技术提供了上述微电极生物传感器在活体实时检测植物赤霉素中的应用。具体地，检测部位为植物的茎、叶、果实或嫩芽。本专利技术提供了一种活体在线检测植物赤霉素浓度的方法，包括：(1)将上述微电极生物传感器连接至电化学工作站，与不同浓度的赤霉素标准溶液反应，在工作电压下通过计时电流法进行连续检测，由浓度与电流关系获得稳定的检测GA3的工作曲线；(2)将上述的微电极生物传感器插入待测植物组织，连接电化学工作站，获取电流变化，导入工作曲线，计算被测样本内赤霉素的浓度。具体地，活体在线检测植物赤霉素浓度的方法的步骤(1)是用CV或DPV法与GA3的标准溶液反应，获得工作电位为0.2V，然后在0.2V工作电位下，用计时电流法检测不同浓度的GA3标准溶液(0、0.1、0.5、1.0、3.0、10、25、60nM)，得到一组电流与浓度的关系曲线Δi＝45.56+12.55lgC(r＝0.9880)具体地，步骤(2)是选用培养至第15天植物幼苗做实验材料，将微电极插入幼苗的嫩茎中，再连接至电化学工作站，在线测定1天内GA3的浓度变化。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种基于微型生物传感技术的植物体内赤霉素的活体在线监测方法，从而更全面、深入地了解植物体内赤霉素的调节规律及作用机制。本专利技术通过在工作电极电沉积Au/Ag核-壳结构复合纳米粒子后，再电聚合L-Cys/GA3分子印迹聚合物，冲洗后获得分子印迹敏感膜，保证检测的灵敏度和特异性。本专利技术通过对活体植物体内GAs的在线监测，原位实时的掌握植物体内GAs的动态变化信息，为了解GAs参与植物生命体系的调控机理提供理论依据。应用本专利技术的微电极生物传感器可实现对植物活体内GAs的在线监测，对被检测样本不造成本质伤害；得到的数据结果可实时动态的反映植物体内GAs的含量变化，实际应用操作简便，易于掌握。附图说明图1为本专利技术所述微电极生物传感器三电极体系外观结构图。图2为本专利技术所述微电极生物传感器的金工作电极制备与检测GAs的示意图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1工作电极的制备(1)微电极阵列通过微机电加工技术(MEMS)制备，包括Ag/AgCl的参比电极，铂对电极及金工作电极，其中裸露导电部分长约5-20mm；将微电极置于0.5M稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描(-0.2～1.6V)得到典型的循环伏安谱图，确保电极表面清洁。(2)制备Au/Ag核-壳结构复合纳米粒子溶胶：将100mL1.0×10-3mol·L-1的HAuCl4溶液加热至沸，向沸液中一次性加入9.34mL0.0378mol·L-1的Na2C6H5O7溶液，保持沸腾15min，自然冷却；取10mL通过上述方法制得的5×10-4mol·L-1金溶胶稀释至100mL加热至沸，向沸液中一次性加入1mL0.0378mol·L-1的Na2C6H5O7溶液，再沸；向沸液中分批加入5mL1×10-2mol·L-1的AgNO3溶液，保持沸腾1h，自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活体在线检测植物赤霉素的微电极生物传感器，具有三电极体系，包括Ag/AgCl的参比电极，铂对电极，金工作电极，其特征在于，所述金工作电极上电沉积Au/Ag核‑壳结构复合纳米粒子溶胶后，再电聚合L‑Cys/GA3分子印迹聚合物。

【技术特征摘要】
1.一种活体在线检测植物赤霉素的微电极生物传感器，具有三电极体系，包括Ag/AgCl的参比电极，铂对电极，金工作电极，其特征在于，所述金工作电极上电沉积Au/Ag核-壳结构复合纳米粒子溶胶后，再电聚合L-Cys/GA3分子印迹聚合物。2.如权利要求1所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述Au/Ag核-壳结构复合纳米粒子溶胶的制备方法为：将100mL1.0×10-3-5×10-3mol·L-1的HAuCl4溶液加热至沸，向沸液中一次性加入9.34mL0.0378-0.5mol·L-1的Na2C6H5O7溶液，保持沸腾15-30min，自然冷却；取10mL通过上述方法制得的金溶胶稀释至100mL加热至沸，向沸液中一次性加入1mL0.0378-0.5mol·L-1的Na2C6H5O7溶液，再沸；向沸液中分批加入5mL1×10-2-5×10-2mol·L-1的AgNO3溶液，保持沸腾1-1.5h，自然冷却。3.如权利要求1所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述L-Cys/GA3分子印迹聚合物的制备方法为：将0.007gGA3加入到100ml蒸馏水中，制备2.0×10-4MGA3原液；将0.0024gL-Cys加入到1.0MNaOH溶液中，用0.04M的PBS溶液稀释至100ml，制备2.0×10-4ML-Cys原液；将L-Cys和GA3的原液以2：1-4:1的体积混合，制备分子印迹聚合物溶液。4.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成，李爱学，赵静，胡叶，王晓冬，侯佩臣，罗斌，宋鹏，高权，陈泉，
申请(专利权)人：北京农业信息技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11