双泡状荧光探针及其应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了双泡状荧光探针及其应用和方法，该荧光探针从5'‑端至3'‑端依次包括锚定序列区Ⅰ，泡状结构Ⅰ、识别序列区、泡状结构Ⅱ和锚定序列区Ⅱ，所述锚定序列区Ⅰ和锚定序列区Ⅱ特异结合靶序列，所述识别序列区与靶序列检测位点杂交，所述泡状结构Ⅰ和泡状结构Ⅱ分别标记有相互作用性的荧光标记系统，且与靶序列杂交形成泡状结构，该探针结构简单，成本低，特异性好，能够用于基因定量分析、检测单碱基变异或检测高度同源性核酸靶分子。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸检测领域，具体涉及双泡状荧光探针，还涉及双泡状荧光探针在基因定量分析、检测单碱基变异或检测高度同源性核酸靶分子中的应用以及含有双泡状荧光探针的试剂盒。
技术介绍
基因表达异常或基因突变常常与疾病相关，如导致恶性肿瘤的癌基因突变，因此基因表达量或基因突变检测对临床疾病监测具有重要意义。现有的检测技术方法众多，主要为针对单碱基变异的荧光探针检测技术，如水解探针(hydrolysisprobes；亦叫TaqMan探针)、杂交探针(hybridizationprobes)、分子信标(molecularbeacons)等是最为常见，也是最为常用的检测技术。但是，上述探针对单碱基变异检测并不理想。一方面针对单碱基变异的上述探针设计难度大，针对同一种单碱基变异，通常需要设计几种以上探针，以便最终筛选到一条特异性最好的探针；另一方面由于杂交动力学原因，探针对单碱基变异的识别能力有限，特异性不理想，由于不同基因型对应的探针熔解温度(meltingtemperature，Tm)极为接近，且探针的整体Tm值较高，上述探针主要依赖于Tm值的微弱差异来控制探针对模板杂交的特异性；因此，针对单碱基变异的荧光探针往往能够与其它未变异的模板(或核酸分子)非特异性杂交，产生假阳性结果。对于单碱基变异中的单核酸酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)，由于野生型或突变型丰度均较高(通常至少达到50％比例)，因此，现有探针检测技术对SNP检测的非特异性对检测结果并不存在太多干扰。但是，针对疾病相关的基因突变，如导致恶性肿瘤的癌基因突变，突变基因的丰度通常较低。随着个体化治疗的发展，对癌基因突变检测的灵敏度提出了极高的要求，要求至少能够检测突变丰度仅有1％左右的突变基因，并且，对肿瘤患者外周血游离DNA的检测灵敏度要求更高。由于存在非特异性杂交而产生的假阳性结果，现有探针技术并不适用于低丰度突变基因的检测需要。因此，急需一种灵敏度更高的探针，能够用于检测突变丰度仅有1％左右的突变基因。
技术实现思路
有鉴于此，为了解决现有探针检测低丰度突变基因灵敏度低，容易出现假阳性的问题，本专利技术首先提供在一种双泡状荧光探针，本专利技术的双泡状荧光探针设计简单，适用范围广，能够用于基因定量分析、单碱基变异检测、DNA或RNA甲基化分析、高度同源性的核酸靶分子的检测，具有高特异性识别能力，能够完全抑制非特异性杂交。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种双泡状荧光探针(图1)，所述荧光探针从5'-端至3'-端依次包括锚定序列区Ⅰ，泡状结构Ⅰ、识别序列区、泡状结构Ⅱ和锚定序列区Ⅱ，所述锚定序列区Ⅰ和锚定序列区Ⅱ特异结合靶序列，所述识别序列区与靶序列检测位点杂交，所述泡状结构Ⅰ和泡状结构Ⅱ分别标记有相互作用性的荧光标记系统，且与靶序列杂交形成泡状结构。探针的3’-末端可以连接有延伸阻断基团，其功能是阻止双泡状荧光探针在核酸扩增体系中的延伸。其阻断基团是在锚定序列区的3'-末端碱基位置修饰磷酸基团、氨基基团，或者在锚定序列区的3'-末端使用反转碱基或双脱氧核苷酸(dideoxynucleotide)。本专利技术中，锚定序列区Ⅰ或锚定序列区Ⅱ的核苷酸(nucleotide,nt)长度无特殊要求，优选长度为8～50nt，GC含量无具体要求，优选25～75％，Tm值远高于识别序列区，通常大于65℃，甚至可高达85℃；泡状结构Ⅰ和泡状结构Ⅱ的核苷酸长度通常为1～12nt，识别序列区的核苷酸长度通常为1～3nt；泡状结构Ⅰ、泡状结构Ⅱ和识别序列区的GC含量无特殊要求，并且通常不考虑其熔解温度(meltingtemperature，Tm)，但因其序列极短，其Tm值通常极低，通常小于30℃。本专利技术中，所述泡状结构Ⅰ或泡状结构Ⅱ含有至少一个错配碱基或核苷酸衍生物，错配碱基的错配优选方案一是GA、CT、TT错配，错配优选方案二是CC错配，错配优选方案三AA和GG错配，错配优选方案四CA和GT错配。上述四种错配优选方案中，错配识别能力大小依次是错配优选方案一至四。核苷酸衍生物可以为脱氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、7-去氮-2’-脱氧肌苷(7-deaza-2’-deoxyinosine)、2-氮杂-2’-脱氧肌苷(2-aza-2’-deoxyinosine)、2’-甲氧基肌苷(2’-OMeinosine)、2’-F肌苷(2’-Finosine)、脱氧3-硝基吡咯(deoxy3-nitropyrrole)、3-硝基吡咯(3-nitropyrrole)、2’-甲氧基3-硝基吡咯(2’-OMe3-nitropyrrole)、2’-F3-硝基吡咯(2’-F3-nitropyrrole)、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(1-(2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)、脱氧5-硝基吡咯(deoxy5-nitroindole)、5-硝基吲哚(5-nitroindole)、2’-甲氧基5-硝基吲哚(2’-OMe5-nitroindole)、2’-F5-硝基吲哚(2’-F5-nitroindole)、脱氧4-硝基苯并咪唑(deoxy4-nitrobenzimidazole)、4-硝基苯并咪唑(4-nitrobenzimidazole)、脱氧4-氨基苯并咪唑(deoxy4-aminobenzimidazole)、4-氨基苯并咪唑(4-aminobenzimidazole)、脱氧水粉蕈素(deoxynebularine)、2’-F水粉蕈素(2’-Fnebularine)、2’-F4-硝基苯并咪唑(2’-F4-nitrobenzimidazole)、肽核酸-5-硝基吲哚(PNA-5-nitroindole)、肽核酸-水粉蕈素(PNA-nebularine)、肽核酸-肌苷(PNA-inosine)、肽核酸-4-硝基苯并咪唑(PNA-4-nitrobenzimidazole)、肽核酸-3-硝基吡咯(PNA-3-nitropyrrole)、吗啉基-5硝基吲哚(morpholino-5-nitroindole)、吗啉基-水粉蕈素(morpholino-nebularine)、吗啉基-肌苷(morpholino-inosine)、吗啉基-4-硝基苯并咪唑(morpholino-4-nitrobenzimidazole)、吗啉基-3-硝基吡咯(morpholino-3-nitropyrrole)、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚(phosphoramidate-5-nitroindole)、氨基磷酸酯-水粉蕈素(phosphoramidate-nebularine)、氨基磷酸酯-肌苷(phosphoramidate-inosine)、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑(phosphoramidate-4-nitrobenzimidazole)、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯(phosphoramidate-3-nitropyrrole)、2’-0-甲氧基乙基肌苷(2’-0-methoxyethylinosine)、2’-0-甲氧基乙基水粉蕈素(2’0-methoxyethyln本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双泡状荧光探针，其特征在于：所述荧光探针从5'‑端至3'‑端依次包括锚定序列区Ⅰ，泡状结构Ⅰ、识别序列区、泡状结构Ⅱ和锚定序列区Ⅱ，所述锚定序列区Ⅰ和锚定序列区Ⅱ特异结合靶序列，所述识别序列区与靶序列检测位点杂交，所述泡状结构Ⅰ和泡状结构Ⅱ分别标记有相互作用性的荧光标记系统，且与靶序列杂交形成泡状结构。

【技术特征摘要】
1.一种双泡状荧光探针，其特征在于：所述荧光探针从5'-端至3'-端依次包括锚定序列区Ⅰ，泡状结构Ⅰ、识别序列区、泡状结构Ⅱ和锚定序列区Ⅱ，所述锚定序列区Ⅰ和锚定序列区Ⅱ特异结合靶序列，所述识别序列区与靶序列检测位点杂交，所述泡状结构Ⅰ和泡状结构Ⅱ分别标记有相互作用性的荧光标记系统，且与靶序列杂交形成泡状结构。2.根据权利要求1所述双泡状荧光探针，其特征在于：所述泡状结构Ⅰ或泡状结构Ⅱ含有至少一个错配碱基或核苷酸衍生物。3.根据权利要求1所述的一种双泡状荧光探针，其特征在于：所述锚定序列区Ⅰ或锚定序列区Ⅱ的核苷酸长度为8～50nt。4.根据权利要求1所述的一种双泡状荧光探针，其特征在于：所述锚定序列区Ⅰ或锚定序列区Ⅱ的GC含量含量为25～75％。5.根据权利要求1所述的一种双泡状荧光探针，其特征在于：所述错配序列区Ⅰ或错配序列区Ⅱ的核苷酸长度为1～12nt。6.根据权利要求1所述的一种双泡状荧光探针，其特征在于：所述识别序列区序列的核苷酸长度为1～3nt。7.根据权利要求1所述的一种双泡状荧光探针，其特征在于：所述3'-端还包括延伸阻断基团。8.根据权利要求7所述的一种双泡状荧光探针，其特征在于：所述阻断基团是在锚定序列区的3'-末端碱基修饰磷酸基团、氨基基团，或者在锚定序列区的3'-末端使用反转碱基或双脱氧核苷酸。9.根据权利要求1所述的一种双泡状荧光探针，其特征在于：所述核苷酸衍生物为脱氧肌苷、肌苷、7-去氮-2’-脱氧肌苷、2-氮杂-2’-脱氧肌苷、2’-甲氧基肌苷、2’-F肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2’-甲氧基3-硝基吡咯、2’-F3-硝基吡咯、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吡咯、5-硝基吲哚、2’-甲氧基5-硝基吲哚、2’-F5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2’-F水粉蕈素、2’-F4-硝基苯并咪唑、肽核酸-5-硝基吲哚、肽核酸-水粉蕈素、肽核酸-肌苷、肽核酸-4-硝基苯并咪唑、肽核酸-3-硝基吡咯、吗啉基-5硝基吲哚、吗啉基-水粉蕈素、吗啉基-肌苷、吗啉基-4-硝基苯并咪唑、吗啉基-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2’-0-甲氧基乙基肌苷、2’-0-甲氧基乙基水粉蕈素、2’-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2’-0-甲氧基乙基4-硝基-苯并...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄庆，赵娜，府伟灵，黄君富，夏涵，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，黄庆，
类型：发明
国别省市：重庆;50