本发明专利技术公开了一种能灵敏和快速地用于结核菌菌体抗原诊断的新型双适配子夹心ELISA试剂盒，其包括ZXL2和ZXL3两个适配子。本发明专利技术利用SELEX筛选得到的DNA单链适配子命名为ZXL2、ZXL3，首次建立该双适配子夹心ELISA试剂盒，将其与结核病的早期诊断结合起来，与临床上传统的抗酸染色检测方法进行比较，特异性提高35个百分点，敏感度由原来的10000CFU/ml提高到100CFU/ml。将传统通过痰培养的诊断方法从过去的2-8周缩减为1天。本发明专利技术操作简单快速，成本低廉，大大提高了对结核病人诊断特异性、敏感性和精确度，特别是提供了一种新型结核抗原早期诊断试剂盒，临床应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子免疫学领域。具体涉及一种能特异性结合毒性分枝杆菌H37RV菌 体表面抗原，而不结合BCG的单链DNA适配子试剂盒及其在结核抗原检测中的应用。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌引起的、人兽共患的慢性消耗性传染病，给人类健康带 来严重威胁。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球目前有近三分之一的人感染结核 杆菌，活动性肺结核病人达2000万，每年有300万人死于结核病，每 年新发病人数800 1000万。1993年，世界卫生组织宣布“全球结核病处于紧急状态”，把结核病列为重点控制 的传染病之一。我国是结核病高负担国家，现有活动性肺结核病人500万人，传染性肺结核病人 200万人，每年新增病例约130万人，因结核病死亡15万人之多(《全国结核病防治规划 (2001-2010年)》，国办发75号文件)。国务院已确定结核病为我国三大重点防治传 染病之一。我国结核病疫情的严重程度仅次于印度，位居世界第二。我国结核病疫情呈三 高一低，即患病率高、死亡率高、耐药率高，年递降率低。近年来由于HIV/AIDS流行、人口流 动、耐药结核菌逐年增加，结核病发病率开始上升，结核病疫情更加严重。运用新型诊断方法对结核病进行早期诊断与治疗具有十分重要的意义，目前国内 外结核已有的诊断技术存在许多缺陷，缺乏特异、有效、快速、方便、廉价的诊断技术和产 品，特别是一直缺乏对结核抗原的敏感早期检测手段。过去PPD (结核菌素纯蛋白衍化物 )也常用于结核病的诊断和流行病学调查，但是其缺乏特异性，敏感性低，有一定应用局限 性；传统的痰抗酸染色的灵敏度难以达到，并且不能区分不同结核分枝杆菌；传统的抗体 检测方法存在窗口期问题，不能达到检测目的，并且不能区分是卡介苗接种还是感染结核 的问题；近些年发展的RT-PCR的诊断方法虽然特异性强，但需昂贵仪器，成本高。临床上对 疑似感染结核的病人，由于缺乏有效的诊断方法，常常采用先抗结核治疗，再以治疗的效果 为依据来进行诊断，如此一来浪费了大量的人力物力，也可能造成对其他疾病的误诊或是 延误治疗。所以，探索新型诊断方法对结核病进行早期诊断研究用于结核病快速、有效、方 便、廉价的特异性检测，特别是急需开发一种比临床上传统使用的抗酸染色方法更灵敏和 快速地用于结核菌抗原诊断的新型试剂，对于及时诊断、治疗结核病人和控制结核病传染 疫情都具有十分重要的意义。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术提供一种能够特异性结合毒性结核分枝杆菌H37Rv的两种 单链DNA适配子试剂盒。本专利技术通过SELEX筛选技术，通过多轮筛选得到两个DNA单链适配子，分别命名为 ZXL2和ZXL3，其核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。ZXL2和ZXL3对结 核分枝杆菌H37Rv具有良好的特异性。基于此，本专利技术提供一种双适配子检测试剂盒，其包括适配子ZXL2和ZXL3。上述试剂盒，适配子ZXL2和ZXL3中的一种包被于酶标板，另一种用生物素标记。 优选ZXL2包被于酶标板，ZXL3用生物素标记。上述试剂盒，其还可进一步包括酶标链霉亲和素、PBST和终止液中的一种或多种。 所述酶标链霉亲和素是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。所述终止液为浓硫酸，优选终止 液为2M的H2SO4。本专利技术首次将此单链适配子与结核病的诊断结合起来，该适配子ZXL2、ZXL3体外 容易合成，且能特异性与结核分枝杆菌H37Rv结核。本专利技术试剂盒比传统的痰抗酸染色的 诊断方法的优点是本专利技术试剂盒能区分毒性结核分枝杆菌与其它分支杆菌包括BCG，并 且可以检测低于104CFU/ml的结核菌，而传统的痰抗酸染色的灵敏度难以达到；与传统的抗 体检测方法相比的优点是能检测抗原，且能缩短窗口期，达到早期诊断目的；与RT-PCR的 诊断方法相比的优点是不需昂贵仪器，成本低。而且DNA单链适配子体外合成非常简单， 而且价格低廉，同时我们专利技术的方法操作简单，操作时间短(1 天完成)，对于结核病人痰培 养阳性的诊断灵敏度和精确度都很高，临床应用前景广阔。附图说明图1双适配子夹心法适配子浓度的确定两种适配子分别与H37RV、BCG结合，IOOnM非生物标记的适配子ZXL2结合细菌，IOnM 生物素标记的适配子ZXL3检测时，非特异性反应最低(0D45C1<0. 2)，确定与结核杆菌H37Rv 结合的ZXL2适配子的最佳浓度为ΙΟΟηΜ，ZXL3适配子的最佳浓度为ΙΟηΜ。图2本专利技术双适配子试剂盒的特异性鉴定图中l、H37Rv ；2、BCG ；3、耻垢分枝杆菌；4、鸟分枝杆菌；5、胞内分枝杆菌；6、藤黄微球 菌；7、绿脓杆菌；8、金黄色葡萄球；9、大肠杆菌；10、金黄色葡萄球菌耐药株；11、白葡萄球 菌。双适配子夹心法可以在环境为PBS，细菌浓度为IO4 CFU/mL的条件下有效的鉴别 出H37Rv与不同非分枝杆菌和分枝杆菌。图3双适配子夹心法检测正常人及病人痰液正常人痰液使用双适配子方法检测时，OD45tl值< 0. 1。结核病人痰液抗酸染色阳性的， 都能与IOOnM浓度的ZXL2适配子和IOnM浓度的ZXL3适配子反应，且有很高的OD值。OD450 值> 0. 2。具体实施例方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指 明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下面凡是涉及到结核 杆菌的操作，均在生物安全柜中操作。本专利技术中非生物素标记即指未标记。实施例1试剂盒适配子浓度的确定 实验方法(1)把从公司合成的生物素标记的ZXL3适配子用无菌的双蒸水分别稀释成10nM，40nM UOOnM,400nM的浓度，_20°C冰箱中保存。(2)把不同种的细菌结核杆菌标准毒株H37Rv，卡介苗，黄微球菌，绿脓杆菌，金 黄色葡萄球菌，肠炎杆菌，金黄色葡萄球菌耐药株，白色葡萄球菌分别在合适的培养基中培 养，其中结核杆菌标准毒株H37Rv，卡介苗(BCG)在改良罗氏培养基中培养，其他细菌在LB 培养基中培养，然后在使用当天，用生理盐水调成不同的浓度。(3)双适配子法最适浓度的鉴定，将100nM，400nM未标记的适配子ZXL2 (用 0. 05mol/L NaHC03> pH值为8. 0稀释)包被96孔板后，在紫外光下暴露常温过夜。弃掉孔 中的液体，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5%。)，洗6次，每孔加入不同浓度(1\1050 ^!111，1\104 CFU/ml、lX103CFU/ml、lX102 CFU/mlUXlO1 CFU/ml)的 H37RV、BCG 100 μ 1，每个浓度 设6个复孔，同时设一个不加细菌的阴性对照孔，4°C，孵育过夜。弃掉孔中的液体，每孔加 300 μ 1 PBST,洗6次，由于每种细菌的每个浓度设8个复孔，因此两种细菌的每个浓度的2 个复孔加一个浓度的适配子，每孔100 μ 1，4°C，孵育过夜。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5 %。)，洗6次，加入不同浓度的生物素标记的适配子ZXL3 (ΙΟηΜ, 40nM、IOOnM, 400nM)，4°C，孵育过夜。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5%本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种双适配子夹心试剂盒，包括ＤＮＡ适配子ＺＸＬ２和ＺＸＬ３，它们的核苷酸序列分别如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：章晓联，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83
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