一种免疫原HM4‑M2e及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种免疫原HM4‑M2e及其制备方法与应用。本发明专利技术以乙肝病毒核心蛋白HM4为载体蛋白，通过SMCC与本发明专利技术设计合成的多肽M2e相交联，得到免疫原HM4‑M2e。通过实验证明：将制备的免疫原HM4‑M2e作为流感疫苗的有效成分，并以适宜的免疫佐剂作为辅料制成的药物有很好的免疫效果。且本发明专利技术所使用的载体蛋白适合于大规模工业化生产的优点，同时交联率高，制备时间短，降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种免疫原HM4-M2e及其制备方法与应用，属于生物

技术介绍
合成肽疫苗(Syntheticpeptidevaccine)是用化学方法合成的病毒保护性抗原多肽疫苗，其安全性好，不会受到病原微生物的污染，且易保存和控制质量。但是合成肽疫苗一般分子量较小且只针对单一抗原位点，免疫原性较差，对序列依赖性的抗原位点免疫效果较好，对构象依赖性位点则较差。乙肝病毒核心蛋白HBc(HepatitisBviruscoreprotein,HBc)由于其天然的颗粒组装能力和特异性激发针对外源表位的体液免疫和细胞免疫的特性，成为载体蛋白研究的热点。近年来，HBc颗粒的应用方面已经有了较成熟研究结果。乙型肝炎病毒核心抗原HBc蛋白由183-185个氨基酸残基(各亚型之间稍有不同)组成，相对分子质量为21000Da，其C端富含精氨酸，有结合核酸RNA的能力，并与其组装成乙肝核心颗粒有关，同时也含有多种蛋白酶作用位点，N端的1～144位氨基酸残基是真正的颗粒装配区。疫苗研究中以HBc作为载体的疫苗抗原有很多，如乙肝病毒表面抗原、人乳头瘤病毒E7蛋白、B群链球菌CPS糖蛋白等，在临床前实验研究中已观察到肯定的疗效。因此，发展以HBc颗粒为载体的流感病毒表位疫苗研究具有很好的前景和应用价值。甲型流感病毒为分节段的单股负链RNA病毒，基因组含8个节段，第7个节段RNA编码M1和M2蛋白。其中M2蛋白是除HA和NA以外的第3个外膜蛋白，从N端到C端依次为：含23个氨基酸的胞外区(M2e)、含19个氨基酸的疏水性跨膜区和含54个氨基酸的胞内区。天然状态下M2以同源四聚体的形式存在于流感病毒表面，每个病毒粒子仅含14～68个M2分子，但感染流感病毒的细胞表面分布着大量M2分子，具有质子通道的作用，在病毒侵染时能降低病毒颗粒内部的pH值，帮助病毒释放RNA。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种多肽。本专利技术提供的多肽是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；b)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。本专利技术的第二个目的是提供一种偶联物。本专利技术提供的偶联物为将上述多肽与载体蛋白通过交联剂交联得到的物质；所述多肽和所述载体蛋白的结合率为(1-3):1。上述偶联物中，所述交联剂为SMCC；所述载体蛋白为乙肝病毒核心蛋白HM4；所述乙肝病毒核心蛋白HM4的氨基酸是如下d)或e)或f)的蛋白质：d)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；e)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；f)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。本专利技术的第三个目的是一种偶联物的制备方法。本专利技术提供的偶联物的制备方法为将上述多肽、载体蛋白和交联剂混匀，反应，得到偶联物。上述方法中，所述交联剂为SMCC；所述载体蛋白为乙肝病毒核心蛋白HM4；所述乙肝病毒核心蛋白HM4的氨基酸是如下d)或e)或f)的蛋白质：d)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；e)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；f)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。上述方法中，所述多肽、所述载体蛋白和所述SMCC的摩尔量比为1:1:30。上述方法中，所述偶联物的制备方法为将多肽溶液、载体蛋白溶液和SMCC溶液混匀，反应，得到偶联物；所述多肽溶液是将上述多肽与PBS缓冲液混匀得到的溶液，所述多肽溶液的浓度为3mg/mL。所述载体蛋白溶液是将所述乙肝病毒核心蛋白HM4与PBS缓冲液混匀得到的溶液，所述载体蛋白溶液的浓度为1.5mg/ml。所述SMCC溶液是将SMCC与DMF(溶剂)混匀得到的溶液，所述SMCC溶液中SMCC浓度为20mg/mL。本专利技术的第四个目的是提供上述偶联物或由上述方法制备得到的偶联物的新用途。本专利技术提供了上述偶联物或由上述方法制备得到的偶联物在制备流感疫苗中的应用。本专利技术的第五个目的是提供一种产品。本专利技术提供的产品的活性成分为上述偶联物或由上述方法制备得到的偶联物；所述产品具有如下功能：制备流感疫苗。本专利技术的第六个目的是提供一种流感疫苗。本专利技术提供的流感疫苗的活性成分为上述产品。上述疫苗中，所述疫苗由权利要求7所述的产品和佐剂组成；所述佐剂为氢氧化铝佐剂；所述产品和所述佐剂的质量比为1：25。上述应用或上述产品或上述流感疫苗中，所述流感疫苗为甲型流感疫苗。本专利技术以乙肝病毒核心蛋白HM4为载体蛋白，通过SMCC(4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)与本专利技术设计合成的多肽M2e相交联，得到免疫原HM4-M2e。通过实验证明：将制备的免疫原HM4-M2e作为流感疫苗的有效成分，并以适宜的免疫佐剂作为辅料制成的药物有很好的免疫效果。且本专利技术所使用的载体蛋白适合于大规模工业化生产的优点，同时交联率高，制备时间短，降低了生产成本。附图说明图1为多肽M2A6的纯度检测。图2为多肽M2A6的分子量检测。图3为多肽M2A6与载体蛋白HM4结合的SDS-PAGE图。其中，1：载体蛋白HM4与多肽M2A6结合前样品；2：免疫原HM4-M2A6；3：载体蛋白HM4标品。图4为HM4载体蛋白、免疫原HM4-M2A6和marker的变性毛细管电泳的检测图谱。其中，图4A为Marker的变性毛细管电泳的检测图谱；图4B为载体蛋白HM4的变性毛细管电泳的检测图谱；图4C为HM4-M2A6免疫原的变性毛细管电泳的检测图谱。其中，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为吸光度值(AU)。图5为多肽M2e、HM4包板检测HM4-M2A6结合疫苗免疫血清ELISA抗体效价。图6为感染A/FM/1/47(H1N1)流感病毒后各组小鼠生存曲线图。图7为感染A/FM/1/47(H1N1)流感病毒后各组小鼠体重变化图。图8为感染A/PR/8/34(H1N1)流感病毒后各组小鼠生存曲线图。图9为感染A/PR/8/34(H1N1)流感病毒后各组小鼠体重变化图。图10为感染A/Victoria/3/75(H3N2)流感病毒后各组小鼠生存曲线图。图11为感染A/Victoria/3/75(H3N2)流感病毒后各组小鼠体重变化图。图12为感染A/Aichi/2/68(H3N2)流感病毒后各组小鼠生存曲线图。图13为感染A/Aichi/2/68(H3N2)流感病毒后各组小鼠体重变化图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的主要试剂及其购买处如下：保护氨基酸(Fmoc氨基酸)，HCTU和RinkAmide-MBHA树脂：上海吉尔生化有限公司；乙腈和苯甲醚：sigma公司；二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷，无水乙醚和三氟乙酸：天津科密欧公司；N-甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；b)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；b)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。2.一种偶联物，为将权利要求1所述的多肽与载体蛋白通过交联剂交联得到的物质；所述多肽和所述载体蛋白的结合率为(1-3):1。3.根据权利要求2所述的偶联物，其特征在于：所述交联剂为SMCC；所述载体蛋白为乙肝病毒核心蛋白HM4；所述乙肝病毒核心蛋白HM4的氨基酸是如下d)或e)或f)的蛋白质：d)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；e)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；f)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。4.一种偶联物的制备方法，为将权利要求1所述的多肽、载体蛋白和交联剂混匀，反应，得到偶联物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述交联剂为...

【专利技术属性】
技术研发人员：安文琪，张静静，马小伟，师方园，姚伟利，梁雪爽，
申请(专利权)人：华兰生物工程股份有限公司，华兰生物疫苗有限公司，华兰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41