本发明专利技术要解决的技术问题是快速高效增殖鸡毒支原体，以用于鸡毒支原体病原的快速检测。为了达到以上目的，本发明专利技术是采用以下技术方案予以实现的：一种鸡毒支原体检测方法，其特征在于：鸡毒支原体液体培养基制备：在大豆木瓜酶消化物中同时使用酵母浸出粉、葡萄糖、胰酶解酪蛋白，实际对传代时间的缩减效果要大于仅使用酵母浸出粉的10%，最短的传代时间可以快至12～16h，多数情况下18h左右可以传代完毕，本发明专利技术利用此为主要的增殖基料配方，使鸡毒支原体病原得以快速检出，为该病的确诊和鸡群的防疫工作提供有效参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原微生物检测领域，具体涉及一种鸡毒支原体快速培养与鉴别方法。
技术介绍
鸡毒支原体（MycoplasmaGalliscepticum,MG）也称鸡败血性支原体，在肉鸡中，MG与其它致病菌可引起禽慢性呼吸道病CRD，此病可导致死亡率、淘汰率及加工过程中废弃率上升；在产蛋母鸡，MG的暴发除造成死亡率上升，其真正危害在于造成产蛋量下降5%～10%。在火鸡中，MG可引起窦炎、气囊炎和以高死亡率为特征的传染性窦炎。该病原广泛分布与世界各地，给养鸡业带来巨大的经济损失；支原体是介于细菌和病毒之间，能营独立生活的一群微生物。支原体对营养的要求较高，在培养基中需额外加入10～20%人或动物血清、辅酶等生长因子才能生长，兼性厌氧，5～10%CO2可促进其生长，不易分离，这给支原体的检测工作带来了困难。针对规模化养禽业，如果能通过简单且快速的方式确定鸡毒支原体的存在情况，则在禽病的防疫工作中会产生巨大经济价值；目前鸡毒支原体的检测存在诸多的问题，即缺乏成体系成套路的检测方法，常见的检测方式重质控，轻速度，或不重检测实际效果，样本检测成品率低等。由于分离病原体需多次传代增值培养，并与L型细菌的鉴别等，以扩增一代至少需要一天来算，检测确定的时间实在太多，还有用于生产疫苗时，往往用大量的浓肉汤培养，增值快速的同时也会使得许多样品杂菌产生过多，以至于醋酸铊都抑制不了，使得许多样本检出率大幅降低，给该病的防治带来很大的隐患。因此研究一种快速准确检测鸡毒支原体的方法具有重大的现实意义。
技术实现思路
本专利技术专利要解决的技术问题是用快速增殖鸡毒支原体，以用于鸡毒支原体病原的检测，为该病的确诊、鸡群的防疫工作提供有效参考。为了达到以上目的，本专利采用以下技术方案予以实现：一种鸡毒支原体检测方法，其特征在于：（1）鸡毒支原体液体培养基制备：所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制：胰酶解酪蛋15～30g、葡萄糖5～15g、大豆木瓜酶消化物3～6g、酵母浸出粉15～30g、1%的醋酸铊溶液5ml；全部均匀混合后置入500ml容量瓶，用去离子水定容到500ml，移出，在120℃，1.8个大气压下灭菌30min，待冷却至常温后，在无菌条件下加入以下成份：经过过滤除菌的5%的精氨酸生素溶液8～12ml、无菌猪血清80～120ml、青霉素80～120万单位。调PH值至7.0～7.4，前述百分比均为质量百分比。在反复选取实验方案中发现，增殖中常用的肉汤类增殖剂，无法用于快速测定，尤其是批量样品的操作测定，因为要使其不出现杂菌，条件非常苛刻，这在批量样品的检测中几乎无法实行，批量样品中大量产生杂菌严重影响检测结果。但是仅仅以酵母浸出粉作为培养料也是不够的，对于鸡毒支原体来说，常常需要2～3天才传一代，通过实验发现，利用胰酶解酪蛋白、葡萄糖、大豆木瓜酶消化物、酵母浸出粉，共同进行培养，增殖速度效果较好。经过反复多批次对比，发现产生杂菌的情况极少，不会影响样品的正常测定。这一组合方式是专利技术人经过反复对比实验并进行分析，在反复实验后得到的，且具备预料不到的技术效果；（2）疑似病料采集：从选自疑似带病批次鸡鼻窦粘液、喉头、气管分泌物之中取至少100个样品，每样品来自不同鸡只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸铊的培养液进行清洗，得到待检样品；（3）初检样提取：将步骤（2）的待检样品按1:10接种于步骤（1）所述鸡毒支原体液体培养基中，在36～37℃培养16～18h，留存该样品液，取部分接种到FM-4固体培养基；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；（4）初检：将接种到FM-4固体培养基的样品37℃培养2～4h，先低倍镜观察菌落是否呈煎蛋状，再以高倍显微镜确认鸡毒支原体；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；（5）复检：对于步骤（4）确认了存在鸡毒支原体的样品，将步骤（3）中对应的留存样品，选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品A，再将传代1次的样品选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品B；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；以高倍显微镜确认鸡毒支原体确认复检样品A和B是否存在鸡毒支原体；并观察菌落形态确认是否L型细菌；（6）PCR扩增检验：设计引物对MG1、MG2，上游引物MG1:5’-GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’，下游引物MG2:5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’，对通过了复检的样品，经过PCR扩增，选出732bp的片段，通过测序，检验其与Genbank中FMG-2鸡毒支原体核苷酸序列相似度；（7）形成报告：通过初检、复检和PCR扩增检验，确认具有鸡毒支原体的样本号码和数量，生成报告。前述检测方法中所利用的FM-4固体培养基，其制备方法为：以PPLO肉汤制成粗制肉汤液体培养基，加入2.5%～3%的琼脂制备成固体，灭菌，冷却至50～60℃，按比例每90ml液体中添加10ml马血清以及1ml10倍浓缩MEM培养液，于2～6℃冷却，制成固体培养基。本专利技术的检测方法，支原体增殖生长良好，而且实施简单，不需要高价设备，成本低，易于操作，适宜在普通的鸡毒支原体检测中推广应用。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明：实施例1一种鸡毒支原体检测方法，其特征在于：（1）鸡毒支原体液体培养基制备：所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制：胰酶解酪蛋白30g、葡萄糖15g、大豆木瓜酶消化物3g、酵母浸出粉15g、1%的醋酸铊溶液5ml。全部均匀混合后置入500ml容量瓶，用去离子水定容到500ml，倒出，在120℃，1.5个大气压下灭菌30min，待冷却至常温后，在无菌条件下加入以下成份：经过过滤除菌的5%的精氨酸生素溶液8ml、无菌猪血清80ml、青霉素80万单位；用0.1%氢氧化钠溶液调PH值至7.0～7.2，前述百分比均为质量百分比；（2）疑似病料采集：从选自疑似带病批次鸡鼻窦粘液、喉头、气管分泌物之中取至少120个样品，每样品来自不同鸡只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸铊的培养液进行清洗，得到待检样品；（3）初检样提取：将步骤2的待检样品按1:10接种于步骤（1）所述鸡毒支原体液体培养基中，在36℃培养16h，留存该样品液，取部分接种到FM-4固体培养基；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；（4）初检：将接种到FM-4固体培养基的样品37℃培养2h，先低倍镜观察菌落是否呈煎蛋状，再以高倍显微镜确认鸡毒支原体；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；（5）复检：对于步骤（4）确认了存在鸡毒支原体的样品，将步骤（3）中对应的留存样品，选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品A，再将传代1次的样品选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品B；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；以高倍显微镜确认鸡毒支原体确认复检样品A和B是否存在鸡毒支原体；并观察菌落形态确认是否L型细菌；（6）PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸡毒支原体检测方法，其特征在于： （1）鸡毒支原体液体培养基制备： 所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制： 胰酶解酪蛋白 15～30g， 葡萄糖 5～15g， 大豆木瓜酶消化物 3～6g， 酵母浸出粉 15～30g， 1%的醋酸铊溶液 5ml， 全部均匀混合后置入500ml容量瓶，用去离子水定容到500ml，移出，在120℃，1.8个大气压下灭菌30min，待冷却至常温后，在无菌条件下加入以下成份： 经过过滤除菌的5%的精氨酸生素溶液 8～12ml， 无菌猪血清 80～120ml， 青霉素 80～120万单位/ml， 用0.1%氢氧化钠溶液调PH值至7.0～7.4，前述百分比均为质量百分比；（2）疑似病料采集：从选自疑似带病批次鸡鼻窦粘液、喉头、气管分泌物之中取至少100个样品，每样品来自不同鸡只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸铊的培养液进行清洗，得到待检样品；（3）初检样提取：将步骤2的待检样品按1:10接种于步骤（1）所述鸡毒支原体液体培养基中，在36～37℃培养16～18h，留存该样品液，取部分接种到FM‑4固体培养基；所述FM‑4固体培养基不含青霉素和醋酸铊； （4）初检：将接种到FM‑4固体培养基的样品37℃培养2～4h，先低倍镜观察菌落是否呈煎蛋状，再以高倍显微镜确认鸡毒支原体；所述FM‑4固体培养基不含青霉素和醋酸铊； （5）复检：对于步骤4确认了存在鸡毒支原体的样品，将步骤（3）中对应的留存样品，选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM‑4固体培养基，称为复检样品A，再将传代1次的样品选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM‑4固体培养基，称为复检样品B；所述FM‑4固体培养基不含青霉素和醋酸铊； 以高倍显微镜确认鸡毒支原体确认复检样品A和B是否存在鸡毒支原体；并观察菌落形态确认是否L型细菌；（6）PCR扩增检验： 设计引物对MG1、MG2，上游引物MG1:5’‑GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA‑3’，下游引物MG2:5’‑CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA‑3’，对通过了复检的样品，经过PCR扩增，选出732bp的片段，通过测序，检验其与Genbank中FMG‑2鸡毒支原体核苷酸序列相似度；（7）形成报告：通过初检、复检和PCR扩增检验，确认具有鸡毒支原体的样本号码和数量，生成报告。...
【技术特征摘要】
1.一种鸡毒支原体检测方法，其特征在于：（1）鸡毒支原体液体培养基制备：所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制：胰酶解酪蛋白15～30g，葡萄糖5～15g，大豆木瓜酶消化物3～6g，酵母浸出粉15～30g，1%的醋酸铊溶液5ml，全部均匀混合后置入500ml容量瓶，用去离子水定容到500ml，移出，在120℃，1.8个大气压下灭菌30min，待冷却至常温后，在无菌条件下加入以下成份：经过过滤除菌的5%的精氨酸生素溶液8～12ml，无菌猪血清80～120ml，青霉素80～120万单位/ml，用0.1%氢氧化钠溶液调PH值至7.0～7.4，前述百分比均为质量百分比；（2）疑似病料采集：从选自疑似带病批次鸡鼻窦粘液、喉头、气管分泌物之中取至少100个样品，每样品来自不同鸡只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸铊的培养液进行清洗，得到待检样品；（3）初检样提取：将步骤2的待检样品按1:10接种于步骤（1）所述鸡毒支原体液体培养基中，在36～37℃培养16～18h，留存该样品液，取部分接种到FM-4固体培养基；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；（4）初检：将接种到FM-4固体培养基的样品37℃培养2～4h，先低倍镜观察菌落是否呈煎蛋状，再以高倍显微镜确认鸡毒支原体；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；（5）复检：对于步骤4...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙晴，张灵智，黄霄，李振，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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