支原体检测和去除方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域。支原体检测和去除方法，包括如下步骤：步骤一，取至少2个反应管，分别为阳性对照管、测试管，阳性对照管内加入阳性支原体DNA，测试管内加入测试培养液；步骤二，将反应管放至PCR反应仪内进行检测，如果测试结果为培养液中存有支原体，跳至步骤三；步骤三，使用支原体清除试剂对支原体进行去除。本发明专利技术通过设有2反应管，便于进行数据的比对，通过PCR反应仪进行测定，相较传统的培养法测试时间缩短了，提高了测试效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及支原体的检测。
技术介绍
哺乳动物细胞的培养，支原体(Mycoplasma)污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。培养法是相对可靠的支原体检测技术，但是该方法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外，通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50％。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供支原体检测和去除方法，以解决上述技术问题。本专利技术所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：支原体检测和去除方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，取至少2个反应管，分别为阳性对照管、测试管，阳性对照管内加入阳性支原体DNA，测试管内加入测试培养液；步骤二，将反应管放至PCR反应仪内进行检测，如果测试结果为培养液中存有支原体，跳至步骤三；步骤三，使用支原体清除试剂对支原体进行去除。本专利技术通过设有2反应管，便于进行数据的比对，通过PCR反应仪进行测定，相较传统的培养法测试时间缩短了，提高了测试效率。步骤一之前，反应管内放置有冻干粉剂，将冻干粉剂溶解；所述冻干粉剂包括DNA聚合酶、支原体的特异性引物和去离子水；步骤二中，通过反应管的变色情况判断测试培养液是否存有支原体。所述冻干粉剂是PCR反应液。所述冻干粉剂包括缓冲液，所述缓冲液包括200mM且pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁DTT、50mM溴酚蓝。mM的单位即为mmol/L。所述冻干粉剂包括磷酸缓冲盐溶液。当作缓冲液的同时，还可以用作裂解液。磷酸缓冲盐溶液pH为7.4。测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化一致，说明测试培养液内含有支原体；测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化不一致，说明测试培养液内含有支原体。阳性对照管的颜色应呈蓝绿色。所述PCR反应仪的反应时间为60分钟，反应温度为61℃。DNA聚合酶包括Bst DNA聚合酶或者显色酶蛋白。DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶时，缓冲液为200mM、pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁DTT、50mM溴酚蓝。DNA聚合酶是显色酶蛋白时，缓冲液为200mM、pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁DTT。DNA聚合酶对温度非常敏感，只允许仪器显示温度与实际温度的温差不超过0.5℃。如果温差超过2℃，将导致酶活性大幅降低，进而扩增速度也大幅降低，阳性对照管可能无法呈现蓝绿色。步骤三中，反应管内放入矿物油1～3ml后，将反应管放至PCR反应仪内进行检测。通过矿物油来代替PCR反应仪中热盖。所述反应管设有一用于输入裂解液的第一进口，所述裂解液是用于破坏细菌的细胞膜使得细菌的DNA释放到溶液中的裂解液；所述裂解液为浓度为0.1moL/L的PBS裂解液。所述第一进口设有一水流传感器，所述水流传感器连接一微型处理器系统，所述微型处理器系统连接一电磁阀，所述电磁阀也位于所述第一进口，且所述水流传感器位于所述电磁阀的进口。便于实现裂解液加入量的自动控制。所述冻干粉剂还包括浓度为0.1moL/L的PBS裂解液。所述冻干粉剂是将原材料充分搅拌均匀后冰冻成块状体，将块状体在0℃以下的环境下研磨成粉末。便于存储于运输。所述冻干粉剂还包括PH试剂。或者所述反应管上设有用于输入PH试剂的第三进口。支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素0.5％～1％、瑞他帕林1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、氧氟沙星0.2％～0.5％、环丙沙星0.5％～0.8％、NaCl1％～1.5％，余量为去离子水。支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、肉桂醛氧氟沙星酰腙0.3％～0.5％、NaCl1％～1.5％，余量为去离子水。支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、肉桂醛氧氟沙星酰腙0.3％～0.5％、NaCl1％～1.5％，银杏叶粉0.1％～0.3％，余量为去离子水。经试验，上述配方的支原体清除效果优异，且无毒性。支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素1％、克拉霉素1.5％、氢吡四环素1.3％、肉桂醛氧氟沙星酰腙0.5％、NaCl1.5％，余量为去离子水。经试验，上述配方的支原体清除效果最佳。且无毒性。所述PCR反应仪上设有一用于放置反应管的放置位，所述放置位的底部设有一重量传感器，所述重量传感器连接所述微型处理器系统。当感应到有反应管放置到PCR反应仪上后，自动进行裂解液的进入。所述反应管上设有用于输入支原体清除试剂的第二进口，所述第二进口设有一水流传感器，所述水流传感器连接一微型处理器系统，所述微型处理器系统连接一电磁阀，所述电磁阀也位于所述第二进口，且所述水流传感器位于所述电磁阀的进口。便于实现裂支原体清除试剂加入量的自动控制。便于在加入支原体清除试剂的同时，计算支原体清除试剂的使用量。所述PCR反应仪包括一温控模块、一电源驱动模块和一显示与接口模块，还包括一PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，微流控芯片包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起，所述下层基板上设有一PCR反应通道，所述PCR反应通道的一端与所述反应管的出料口导通；所述反应管的出料口位于所述反应管的下端部；所述温控模块包括一用于改变PCR反应通道温度的半导体温控片、一用于测量PCR反应通道温度的温度传感器；所述半导体温控片贴合在微流控芯片的双面，微流控芯片单面的数量设有至少两个，半导体温控片的排列方向平行于PCR反应通道的导流方向。所述反应管的出料口设有一止回阀，防止溶液逆流。所述出料口上设有一T型运动件，所述T型运动件与一弹簧的一端固定连接，所述弹簧的另一端与所述反应管的下端面固定连接，所述弹簧的弹性方向平行于所述T型运动件的运动方向；所述T型运动件包括用于控制出料口水流通断的挡板，所述挡板为所述T型运动件的上端部；所述放置位是一与所述出料口相匹配的插口，所述插口上设有导流槽，所述导流槽的正中央设有一突起，所述突起的中心线与所述弹簧的中心轴线处于同一直线上，所述导流槽的下端面设有与所述PCR反应通道导通的通孔。本专利技术通过优化反应管的结构，从而实现将反应管放置于放置位上时，出料口与放置位上的导流槽的导通，反应管内的液体经出料口流至插口。当反应管放置与插口上时，插口上的突起带动T型运动件运动，T型运动件通过挡板控制出料口的水流导通至插口导流槽内的通孔。实现通过所述T型运动件控制所述第一出水口与所述插口上导流槽的导通情况。插口上的突起带动T型运动件运动的同时，弹簧伸长，当反应管移出时，弹簧收缩，实现回复。或者，所述出料口上设本文档来自技高网...

【技术保护点】
支原体检测和去除方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，取至少2个反应管，分别为阳性对照管、测试管，阳性对照管内加入阳性支原体DNA，测试管内加入测试培养液；步骤二，将反应管放至PCR反应仪内进行检测，如果测试结果为培养液中存有支原体，跳至步骤三；步骤三，使用支原体清除试剂对支原体进行去除。

【技术特征摘要】
1.支原体检测和去除方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，取至少2个反应管，分别为阳性对照管、测试管，阳性对照管内加入阳性支原体DNA，测试管内加入测试培养液；步骤二，将反应管放至PCR反应仪内进行检测，如果测试结果为培养液中存有支原体，跳至步骤三；步骤三，使用支原体清除试剂对支原体进行去除。2.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：步骤一之前，反应管内放置有冻干粉剂，将冻干粉剂溶解；所述冻干粉剂包括DNA聚合酶、支原体的特异性引物和去离子水；步骤二中，通过反应管的变色情况判断测试培养液是否存有支原体。3.根据权利要求2所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化一致，说明测试培养液内含有支原体；测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化不一致，说明测试培养液内含有支原体。4.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：DNA聚合酶包括Bst DNA聚合酶或者显色酶蛋白；所述PCR反应仪的反应时间为60分钟，反应温度为61℃；步骤三中，反应管内放入矿物油1～3ml后，将反应管放至PCR反应仪内进行检测。5.根据权利要求2所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：所述冻干粉剂还包括浓度为0.1moL/L的PBS裂解液；所述冻干粉剂是将原材料充分搅拌均匀后冰冻成块状体，将块状体在0℃以下的环境下研磨成粉末。6.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：所述反应管上设有用于输入支原体清除试剂的第二进口，所述第二进口设有一水流传感器，所述水流传感器连接一微型处理器系统，所述微型处理器系统连接一电磁阀，所述电磁阀也位于所述第二进口，且所述水流传感器位于所述电磁阀的进口。7.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：所述PCR反应仪包括一温控模块、一电源驱动模块和一显示与接口模块，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周静，杨妍，刘迪慧，温韬，
申请(专利权)人：上海源培生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31