本发明专利技术涉及一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用，属于生物技术领域。杜仲几丁质酶(EuCHIT2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述编码杜仲几丁质酶的基因，其序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术从杜仲中克隆了一个几丁质酶基因，通过遗传转化该基因能够提高烟草对烟草白粉病的抗性，同时提高了植物防御相关基因的表达、保护性酶酶活、降低逆境对细胞膜的伤害、提高植物游离脯氨酸的含量，从而增强植物的抗病能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
,尤其关于杜仲抗烟草白粉病几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用。
技术介绍
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是中国传统中草药，其明显的抗菌作用在长期临床运用中得到了很好的验证。化学分离提取的杜仲总蛋白物对多种植物病原真菌和细菌的生长具有明显的抑制作用，从中纯化获得的EAFP1，EAFP2，并对马铃薯疫病菌(P.infestans)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)、棉花炭疽病菌(C.gossypii)和番茄枯萎病菌(A.lycopersici)的生长抑制作用，对这两个蛋白的结构分析发现他们具有几丁质结合结构。几丁质酶广泛的存在于动植物和微生物的组织和细胞中，它能以真菌细胞壁的重要组成成分——几丁质为底物，将其水解成为N－乙酰氨基葡萄糖，当植物受到生物和非生物因素胁迫时，植物几丁质酶的转录表达量会迅速提高。因此普遍认为几丁质酶是植物重要的病程相关蛋白(Pathogenesis-related protein，PR)。全球每年由于烟草白粉病害在田间所造成的损失介于30％-80％不等，贵州省是中国的烟草种植大省，气候湿润白粉病害严重，每年烟草白粉病害给本省的烟草产业造成巨大损失。目前对烟草白粉病的防治方式主要以化学防治方式为主，但使用遗传转化杜仲几丁质酶基因以提高烟草对烟草白粉病的抗性的研究未见报导。
技术实现思路
针对上述领域中的空白，本专利技术提供一种杜仲几丁质酶(EuCHIT2)，对烟草白粉病的防治有明显的作用。本专利技术的目的之一是提供一种杜仲几丁质酶。本专利技术另一目的是提供编码上述杜仲几丁质酶的基因序列。本专利技术另一目的是提供上述杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。杜仲几丁质酶(EuCHIT2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述编码杜仲几丁质酶的基因。所述基因序列如SEQ ID NO：1所示。杜仲几丁质酶的表达载体，含有编码上述杜仲几丁质酶的基因。所述表达载体的骨架载体为pSH-35S。杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。所述应用为将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使植物增强植物的抗病能力；或者所述应用为将杜仲几丁质酶作为药效成分制成药剂用于增强植物的抗病能力。所述应用为将上述表达载体转化根瘤农杆菌LBA4404，遗传转化烟草，使其增强抗病能力。所述抗病能力为抗真菌感染的能力。所述真菌为白粉病。本专利技术提供一种杜仲几丁质酶及其编码基因与应用，根据已经构建的杜仲转录组注释的几丁质酶基因部分序列,设计RACE扩增引物，提取杜仲的总mRNA反转cDNA为模板，扩增基因的5’端和3’端序列，经过overlap拼接获得全基因序列，根据拼接结果设计开放阅扩增引物。EuCHIT2的开放阅读框及其编码的氨基酸进行了NCBI blastp和blastn分析。ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)对它的结构域modif进行分析后发现在33-52个氨基酸处找到一个几丁质的连接区序列为ccsnfgwcgntpeyc，在95-117个氨基酸处fytydafisaarsfagfa，221-231个氨基酸处isfrtaiwfwm分别找到了两处几丁质酶19家族的开放阅读框编码的氨基酸序列，在对几丁质酶基因进行生物信息学分析基础上，构建植物表达载体遗传转化烟草。转基因烟草与野生型烟草相比，该转基因烟草对烟草白粉病这一植物真菌病害有一定的抗性，通过qRT-PCR检测技术发现该基因的转入对烟草的系统获得性抗性(SAR)的标志基因PR-1a的表达量在接种白粉病后大幅度提高，对植物诱导系统抗性(ISR)的标志基因COI1的表达量在植物健康状态有所提高。对转基因烟草和野生型烟草的保护性酶活检测结果表明，该基因的转入在接种白粉病后能够提高烟草中的POD酶的酶活和游离脯氨酸的含量，除48h检测结果，转基因烟草中MDA含量在接菌前和接菌后均低于野生型烟草，对抗病性相关基因表达量分析的结果和保护性酶活的测定结果表明该基因可以用于对植物真菌病害的防治。附图说明图1是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶基因5’-RACE和3’-RACE PCR产物电泳图和EuCHIT2开放阅读框扩增；图2植物表达载体pSH-35s-EuCHIT2；图3是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶几丁质结合和催化位点预测图；图4是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶进化树分析图；图5是本专利技术实施例1中构建植物表达载体pSH-35S-EuCHIT2验证图；图6是本专利技术实施例1中杜仲几丁质酶遗传转化烟草过程和转基因烟草验证图；图7是本专利技术实施例1中转杜仲几丁质酶基因烟草抑菌试验图(白粉病)；图8是本专利技术实施例1中转杜仲几丁质酶基因烟草抗病相关基因表达量分析；图9是本专利技术实施例1中转杜仲几丁质酶基因烟草抗病相关生理生化指标分析；具体实施方式为了更为清楚的解释本专利技术的目的和技术方案以及优点，结合附图对本专利技术进一步详细的说明。此处描述的具体的实施方法仅用以解释本专利技术。实验中用到的引物序列见下表。实验步骤：1)本实验使用贵州农业生物工程重点实验室试验示范基地种植10余年生杜仲为材料，采集雌雄株幼芽、叶片、幼枝、树皮及雌株幼果提取总RNA，反转cDNA。总RNA的提取采用omega公司的Plant RNA Kit的说明进行称取50mg样品液氮充分研后放入1.5ml的离心管中，加入500ul的RCL和10ul的β-巯基乙醇充分震荡，55℃静置1-5min，14，000g离心5min，将上清转移至gDNA FilterColmn的过滤柱中，室温14，000g离心2min，滤液中加入等体积的RCB液混匀，将混匀液转移至HiBind RNA Mini Column吸附柱中10，000g 1min弃液,400ul的RWC加入吸附柱中10，000g 1min弃液，更换收集管，在吸附柱子加入500ul的RNA Wash bufferII 10，000g 1min弃液,重复步骤8，将500ul的无水乙醇加入吸附柱中洗涤2次去除多余的盐分，空管离心2min，将吸附株转移到新的1.5ml的离心管中并加入40ul Rnase-free水10，000g 1min洗脱样品，-80℃保存。5’-和3’-RACE-Ready cDNA的制备方法参照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit说明书制备。用于RT-PCR分析的烟草的RNA的提取使用以下方法，100mg的杜仲植物组织，液氮充分研磨后加入1ml的Fruit-mateTMfor RNA Purification室温溶化以后，转移至新的1.5ml的离心管中12，000g 4℃离心5分钟，小心吸取上清液，平均分至2个新的1.5ml离心管中，分别加入等体积的RNAiso Plus(Takara，Dalian,China)充分震荡混匀，室温放置10min，分别加入1/5体积的氯仿，充分震荡后室温放置15min，12，000g 4℃离心15min将上清液移至新的离心管中，并加入等体积的异丙醇轻轻混匀,-20℃的放置15min、12，000g 4℃离心10min、去上清沉淀中加入1ml75％的乙醇清本文档来自技高网...
【技术保护点】
杜仲几丁质酶(EuCHIT2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.杜仲几丁质酶(EuCHIT2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.编码权利要求1所述的杜仲几丁质酶(EuCHIT2)的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。4.一种表达载体，含有权利要求1或2所示的基因。5.根据权利要求4所述的表达载体，其骨架载体为pSH-35S。6.杜仲几丁质酶(EuCHIT2)在植物基因工程中的应用。7.根据权利要求6所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵德刚，董璇，李岩，郭林霞，冉新，丁延庆，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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