本发明专利技术公开了一种制备具有免疫调节和抗肿瘤低分子牡蛎多糖的方法。该方法包括新鲜牡蛎肉的清洗，高温高压热水浸提，sevage法除蛋白，30％-70％乙醇沉淀，沉淀溶于水后，经-30℃至-80℃反复冻融离心，取上清经Sepharose CL-6B凝胶柱层析纯化后冷冻干燥或烘干。本多糖可显著提高肿瘤浸润树突状细胞MHC-II、CD86等分子的表达，促进肿瘤浸润树突状细胞所致CD4+T细胞的增殖和IL-2、IFN-γ等细胞因子的产生，而且，本多糖能明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长。本发明专利技术的低分子牡蛎多糖具有显著的免疫调节和抗肿瘤作用，在食品及医药行业具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物多糖的分离纯化
，具体涉及。
技术介绍
肿瘤逃避机体的免疫系统已成为人类肿瘤免疫治疗的一个重大问题。近年来研究发现，树突状细胞不仅是最强的抗原提呈细胞，而且具有调节免疫反应、诱导免疫耐受的作用。特别是肿瘤浸润树突状细胞，其表型一旦被肿瘤改变，主要表现为MHC-1I和CD86等的表达缺失，即可诱导免疫耐受，从而支持肿瘤细胞的免疫逃逸。设法扭转肿瘤浸润树突状细胞的免疫耐受，已成为抗肿瘤免疫治疗的一个重要靶点。从自然界提取的多种多糖化合物有显著的抗肿瘤活性，主要与其具有免疫调节作用有关，在抗肿瘤方面，多糖类成分主要通过作用于免疫系统中各种淋巴细胞(如单核巨噬细胞、Τ、B淋巴细胞等)的增殖，促进工L-2、TNF、IFN等细胞因子的分泌以及抗体的生成，发挥其特异的抑瘤或杀瘤作用；多糖还能通过细胞毒性作用、诱导细胞凋亡、清除自由基和抑制血管生成等方式发挥其抗肿瘤作用。目前己发现部分多糖有明显的抗肿瘤活性。范引科等研究表明多糖对小鼠移植性实体瘤具有明显的抑制作用，多糖具有拮抗环磷酞胺对小鼠血清溶血素生成的抑制作用，明显增强免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。李健等研究表明龙葵多糖具有抑制腹水型肿瘤U14生长、延长荷瘤小鼠存活时间的作用，推测该多糖可能是通过激活机体内免疫系统的活动，进而调节细胞因子的分泌而发挥其抗肿瘤作用。宋高臣等研究表明桦菌芝多糖能够抑制HepA小鼠肿瘤生长，增加免疫器官重量，促进体内工L-2的产生，提高小鼠单核吞噬细胞功能，说明桦菌芝多糖作为生物诱导剂能够增强荷瘤小鼠的免疫功能，从而起到抗肿瘤作用。付桃利等研究表明，多糖对机体的免疫系统受到严重的肝损伤有明显疗效。牡蛎是一种具有药用价值的海洋经济贝类动物，其肉中除含有丰富的蛋白质外还存在大量的糖原和多糖，也开发出了牡蛎多糖的多种用途，包括降血压、抗凝血、提高免疫功能、抗白细胞下降等。目前，已公开多种牡蛎多糖的制备方法，一般都是利用热水浸提法进行粗提，然后再以酸、碱、乙醇等作为溶剂进行后续处理等。如陈骞等公开了牡蛎糖原的提取方法，包括采用热水浸提、醇沉及除蛋白等步骤制备了牡蛎糖原，分子量分布范围为1.0X 104-4.0X 107D;专利CN101012285B公开了制备牡蛎多糖的方法，包括:取大连湾牡蛎或太平洋牡蛎，用0?10°C的水清洗牡蛎;用0.3?0.5MPa压力，70?80°C温度煮牡蛎20?45分钟，过滤、收集上清液;离心去沉淀，将上清液用浓度60?70 %的乙酸调至pH5-6，酸解1?3h，用膜分离器截留分子量为30000Da以下的物质；用NaOH调解30000Da以上滤液的pH至6-8，离心去沉淀，取上清液在蒸馈水中透析除盐;通过Sephadex G-100分子筛层析柱，收集0D280nm吸收峰，透析除盐后冷冻干燥，最终获得了相对分子量为4000-6500Da的牡蛎多糖。从天然生物中分离的多糖多为大分子量的多糖，把较高分子质量的多糖降解为低分子质量，能显著提高其活性，制备低分子质量的多糖已为新药筛选的一个重要方向。牡蛎肉提取物具有多种生物活性，至今对牡蛎高分子量多糖体的免疫调节作用也有研究，但尚未见对牡蛎低分子多糖的报道。现有技术提取牡蛎多糖的方法很多，如何有效的制备获得具有高效生物活性、具有免疫调节和抗肿瘤活性的低分子量牡蛎多糖，是本领域内面临的技术问题。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的上述问题，专利技术人通过研究，提供了一种具有免疫调节和抗肿瘤作用的低分子量牡蛎多糖的提取方法，通过该方法可以有效提取获得高纯度、分子量为1900-2000D的低分子量牡蛎多糖，进一步通过生物实验研究，该低分子量多糖具有良好的免疫调节功能和抗肿瘤效果。具体的，本专利技术涉及以下技术方案:首先，本专利技术公开了一种低分子量牡蛎多糖的提取方法，包括如下步骤:(1)将新鲜牡蛎去外壳，牡蛎肉用清水冲洗；(2)将步骤(1)所得的牡蛎肉进行高压热水浸提，提取温度110-130°c，提取压力为2000-2500hPa，时间1_3小时，过滤得提取液上清液；(3)将步骤(2)所得上清液减压浓缩，用sevage法去蛋白；(4)将步骤(3)去蛋白后所得液体减压浓缩采用乙醇沉淀；(5)将步骤(4)所得沉淀加蒸馏水溶解；(6)将步骤(5)所得溶解液经-30°C-_80°C反复冻融和离心2-3次，去除沉淀，取上清液，减压浓缩；(7)步骤(6)减压浓缩后的溶液经Sepharose CL-6B凝胶柱层析纯化，采用硫酸-苯酚法检测，收集在490nm最大吸收峰的洗脱液，所得洗脱液经冷冻干燥或烘干，即为低分子牡蛎多糖。本专利技术所述方法通过各工序顺序、各步骤工艺条件的结合，可以有效的将较高分子质量的多糖处理为低分子质量多糖，并结合纯化，最终提取到分子量1900-2000D的低分子量牡蛎多糖。专利技术人通过多次试验尝试，不同的工艺条件的组合和工艺参数条件下，可获得多种均一多糖，其分子量相差较大，其活性(免疫调节活性和抗肿瘤性质)也不同，专利技术人通过筛选，最终获得了本专利技术所述具有免疫调节和抗肿瘤活性的低分子牡蛎多糖。优选的，步骤(2)中，高压热水浸提的蒸馏水与牡蛎肉的液料比为3-6:1，更优选的，液料比为5:1。优选的，步骤(2)中，高压热水浸提取温度121°C，提取压力为2300hPa，时间1-3小时，提取次数1-3次。优选的，步骤(3)中，上清液在40°C条件下减压浓缩，用sevage法去蛋白3-5次。高压热水浸提后降温进行浓缩，可以提高浓缩效率。优选的，步骤⑷中，用最终浓度30% -70 %乙醇沉淀。优选的，步骤(5)中，沉淀按液料比5:1加蒸馏水溶解优选的，步骤(6)中，离心条件为10，OOOrpm，lOmin。其次，本专利技术还公开了上述方法制备得到的低分子量多糖。低分子牡蛎多糖的分子量为 1900-2000D。进一步的，本专利技术还公开了所述低分子量多糖用于制备免疫调节的产品的用途。所述免疫调节为促进⑶4+T细胞的增值效应和IL-2、IFN- γ的产生。本专利技术还公开了所述低分子量多糖用于制备抗肿瘤产品和/药物中的用途。优选的，所述肿瘤包括肉瘤(纤维肉瘤)、黑色素瘤等。本专利技术通过将所得低分子牡蛎多糖用RPM1-1640配置成一系列浓度溶液，作用于小鼠roil C+树突状细胞，可显著促进⑶11C+树突状细胞细胞表面MHC-11、⑶86、⑶80、⑶40等分子的表达，促进其对同种⑶4+T细胞的增值效应和IL-2、IFN-y的产生，呈现剂量依赖性。口服或注射低分子多糖(lg/kg)，对多种荷瘤小鼠的肿瘤(小鼠肉瘤S-180、小鼠纤维肉瘤Meth-A、小鼠黑色素瘤B16)生长均有显著抑制作用。本专利技术取得了以下有益效果:(1)本专利技术通过对现有牡蛎多糖提取工艺进行调整和优化，通过改变提取条件和工序，可以有效的把较高分子质量的牡蛎多糖降解为低分子质量牡蛎多糖，并结合凝胶柱层析纯化进行低分子量牡蛎多糖的有效分离，得到了分子量1900-2000D的低分子量牡蛎多糖。(2)本专利技术所制备得到的低分子量牡蛎多糖具有良好的免疫调节作用，可以促进CD4+T细胞的增值效应和IL-2、IFN- γ的产生，提高免疫能力;而且，本专利技术所述低分子量牡蛎多糖具有明显的抗肿瘤效果，对于多种荷瘤肿瘤细胞(小本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种低分子量牡蛎多糖的提取方法，包括如下步骤：(1)将新鲜牡蛎去外壳，牡蛎肉用清水冲洗；(2)将步骤(1)所得的牡蛎肉进行高压热水浸提，提取温度110‑130℃，提取压力为2000‑2500hPa，时间1‑3小时，过滤得提取液上清液；(3)将步骤(2)所得上清液减压浓缩，用sevage法去蛋白；(4)将步骤(3)去蛋白后所得液体减压浓缩采用乙醇沉淀；(5)将步骤(4)所得沉淀加蒸馏水溶解；(6)将步骤(5)所得溶解液经‑30℃–‑80℃反复冻融和离心2‑3次，去除沉淀，取上清液，减压浓缩；(7)步骤(6)减压浓缩后的溶液经Sepharose CL‑6B凝胶柱层析纯化，采用硫酸‑苯酚法检测，收集在490nm最大吸收峰的洗脱液，所得洗脱液经冷冻干燥或烘干，即为低分子牡蛎多糖。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钟鸣，王婷婷，王光辉，车建途，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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