包括多核苷酸剂的细胞靶向纳米颗粒及其应用制造技术

公开了一种产生颗粒的方法，所述颗粒用于输送多核苷酸至靶细胞。所述方法包括(a)使多核苷酸与包括阳离子分子的组合物接触，其中阳离子分子通过静电相互作用凝聚多核苷酸，以产生复合体，其中阳离子分子不包括在脂质体中；和(b)使复合体在等于或小于约4.5的pH下共价结合至靶向部分，从而产生用于输送多核苷酸剂至靶细胞的颗粒。也公开了所述颗粒和包含所述颗粒的组合物的应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】公开了一种产生颗粒的方法，所述颗粒用于输送多核苷酸至靶细胞。所述方法包括(a)使多核苷酸与包括阳离子分子的组合物接触，其中阳离子分子通过静电相互作用凝聚多核苷酸，以产生复合体，其中阳离子分子不包括在脂质体中；和(b)使复合体在等于或小于约4.5的pH下共价结合至靶向部分，从而产生用于输送多核苷酸剂至靶细胞的颗粒。也公开了所述颗粒和包含所述颗粒的组合物的应用。【专利说明】包括多核苷酸剂的细胞靶向纳米颗粒及其应用 本申请是分案申请，原申请的申请日为2010年7月29日，申请号为 201080037976. 6 (PCT/IL2010/000614)，专利技术名称为"包括多核苷酸剂的细胞靶向纳米颗粒 及其应用"。 专利技术的领域和背景 本专利技术，在其一些实施方式中，涉及包括多核苷酸剂的细胞靶向纳米颗粒及其应 用。 大部分癌是不一致的并包含相对抗化疗/放疗的细胞亚群。这些细胞不被治疗消 除并可能是癌复发的根源。一种最主要的理论是，瘤由瘤中的称为癌干细胞或瘤引发细胞 (T-IC)的这类稀少抗药细胞引起，这类抗药细胞具有与正常组织干细胞一样的性质。这些 细胞可自我更新并可在体外和体内不确定地传代并可分化为多种细胞系。重要地，在免疫 缺陷小鼠中，它们比瘤细胞的大部分恶性得多，形成具有许多较少数细胞的瘤，并通常瘤是 更具转移性的。 ^ 所有T-IC的一个共同特征是高表达⑶44,称为（⑶44s )。具有或没有几个其他 标记（诸如⑶133、⑶24ffi或OT24+、⑶166和EpCAM)的⑶44*出现在血液瘤和实体瘤，其中 有乳腺癌、胰腺癌、白血病、脑癌和黑素瘤。 大部分癌干细胞相对抗药并比瘤细胞的大部分恶性得多。所以有必要开发解决该 亚群的疗法，以成功治疗不同类型的癌干细胞。 尽管只在最近RNA干扰（RNAi)才展示在哺乳动物中，但是利用RNAi用于人类疗 法的前景发展迅速。使用siRNA治疗黄斑变性和呼吸道合胞体病毒感染的I期和II期临 床研究令人鼓舞。 但是，许多这些有希望的疗法通过局部注射siRNA进入异种移植瘤中实现。利用 RNAi用于癌疗法的最大障碍是不仅在原发性瘤中而且在隐匿性转移和播散性疾病中全身 性输送siRNA至沉默基因表达。 已经开发了全身性靶向白细胞的颗粒。通过将SiRNA与由细胞靶向部分（对内 在化白细胞整合蛋白的抗体片段或细胞表面受体配体）和诸如鱼精蛋白的RNA结合肽组 成的融合蛋白混合形成这种颗粒。siRNA 融合蛋白 纳米颗粒的静脉注射特别靶向并抑制肺部造血细胞瘤。另外，已经显示抗-整合蛋白抗 体修饰的脂基纳米颗粒可选择性地输送siRNA至参与肠炎症的白细胞。通过改变修饰颗粒表面的抗体，该平台可用于靶向不同的细胞表面 受体。但是，这是一个不能解决靶向癌干细胞能力的复杂策略。 国际申请 W02009/020270 和 Jiang 等教导了一 种使用包括聚乙烯亚胺和透明质酸的组合物的核酸输送系统。该组合物在高于4. 5的pH 下产生。产生的颗粒具有3. 6、13. 2和24. 9的ζ电位，大小为21nm。 Taetz 等教导了使在先附着 于透明质酸的脂质体与siRNA反应，产生脂复合物（lipoplex)，用于治疗癌。脂复合物的大 小在100-200nm之间，ζ电位约-40mV。 Surace 等教导了使用在先 附着于透明质酸的脂质体与质粒DNA-起形成脂复合物。该脂复合物显示负的ζ电位并 且平均直径在250-300nm之间。 Han Su-Eun 等教导了使 用包括聚乙烯亚胺和透明质酸的组合物的核酸输送系统。该组合物在高于4. 5的pH下产 生。产生的颗粒的ξ电位在45-70mV之间并且直径约为185nm。 Herringson等教 导了将siRNA封装入中性隐性脂质体（stealth liposome)并结合⑶4配体。该脂质体平 均直径为243nm并且ζ电位为-11. 5mV和-I. 5mV。 Chono 等，Journal of Controlled Release,第 131 卷，第 1，期，2008 年 10 月 6 日，64-69页，教导了包括脂质体、鱼精蛋白和透明质酸的纳米颗粒制剂，用于全身性输送 siRNA进入瘤。 另外的
技术介绍
包括美国专利号7, 544, 374和美国专利申请号20090155178,其 教导了作为基因输送材料的非均匀的脂化糖胺聚糖颗粒群。
技术实现思路
根据本专利技术一些实施方式的一方面提供了产生颗粒的方法，所述颗粒用于输送多 核苷酸至靶细胞，所述方法包括： (a)使多核苷酸与包括阳离子分子的组合物接触，其中所述阳离子分子通过静电 相互作用凝聚多核苷酸，以产生复合体，其中所述阳离子分子不包括在脂质体中；和 (b)使复合体在等于或小于约4. 5的pH下共价结合至靶向部分，从而产生用于输 送多核苷酸剂至靶细胞的颗粒。 根据本专利技术一些实施方式的一方面提供了根据本专利技术任何一种方法产生的颗粒。 根据本专利技术一些实施方式的一方面提供了包括多个本专利技术颗粒的组合物。 根据本专利技术一些实施方式的一方面提供了包括基本上均匀颗粒群的组合物，所述 颗粒包括SiRNA和阳离子分子的核心以及包括靶向部分的外壳， 其中颗粒群的每个颗粒包括约_40mV的ζ电位并且其中颗粒群的每个颗粒当在 溶液中时直径约为100_300nm。 根据本专利技术一些实施方式的一方面提供了包括基本上均匀颗粒群的组合物，所述 颗粒包括miRNA和阳离子分子的核心以及包括靶向部分的外壳， 其中颗粒群的每个颗粒当在溶液中时直径约为30_50nm。 根据本专利技术一些实施方式的一方面提供了下调靶细胞中感兴趣基因的方法，该方 法包括使颗粒与靶细胞接触，其中颗粒根据本专利技术的方法产生并且靶细胞表达CD44,从而 下调靶细胞中感兴趣基因。 根据本专利技术一些实施方式的一方面提供了治疗有需要的对象中癌的方法，该方法 包括给该对象施用治疗有效量的颗粒，所述颗粒根据本专利技术的方法产生，从而治疗癌。 根据本专利技术的一些实施方式，多核苷酸包括DNA。 根据本专利技术的一些实施方式，多核苷酸包括RNA。 根据本专利技术的一些实施方式，多核苷酸为单链的。 根据本专利技术的一些实施方式，多核苷酸为双链的。 根据本专利技术的一些实施方式，多核苷酸包括RNA沉默剂。 根据本专利技术的一些实施方式，RNA沉默剂选自siRNA、miRNA、反义寡核苷酸和核糖 核酸酶。 根据本专利技术的一些实施方式，RNA沉默剂包括siRNA或miRNA。 根据本专利技术的一些实施方式，阳离子分子选自阳离子多肽、阳离子脂质、阳离子表 面活性剂和合成聚合物。 根据本专利技术的一些实施方式，阳离子脂质选自1，2_二月桂酰-sn-甘油基 (Glicero)-3-磷酸乙醇胺（DLPE)和1，2-二月桂酰-sn-甘油基-3-丙三醇）（DLPG)，二油 酰-1,2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷（D0TAP，以 18:1、14:0、16:0、18:0)和 N-_N，N，N-三甲基氯化铵（DOTMA);二甲基双十八基铵（DDAB) ;1，2-二月桂 酰-sn-丙三醇-3-乙基磷酸胆碱（乙基 PC，以 12:0、14:0、16:0、18:0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于输送多核苷酸至靶细胞的颗粒，其包括多核苷酸和阳离子脂质之间的由包含糖胺聚糖的外壳围绕的复合体的核心，所述糖胺聚糖作为靶向部分共价结合至所述复合体，其中所述复合体：(i)不包括在脂质体中；(ii)包括‑25至‑50mV的ζ电位；和(iii)当在溶液中时直径约为100‑300nm。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·皮尔，
申请(专利权)人：特拉维夫大学拉莫特有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL