一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN或OR)、异丙醇、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法（GC）检测反应进程，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN或OR)。本发明专利技术反应步骤简单、成本较低、产品纯度高，可大规模生产(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN或OR)的绿色生物制备方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，其特征在于：在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN或OR)、异丙醇、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法（GC）检测反应进程，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN或OR)。本专利技术反应步骤简单、成本较低、产品纯度高，可大规模生产(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN或OR)的绿色生物制备方法。【专利说明】
本专利技术涉及生物不对称合成领域，具体涉及。
技术介绍
他汀类药物是目前世界上最畅销的药物大类，它对胆固醇合成的关键限速酶3-羟基-3-甲基辅酶A (HMG-CoA)还原酶具有强烈的抑制作用，可抑制胆固醇的合成，是治疗心血管疾病的重要药物，特别是阿托伐他汀和罗素伐他汀近些年都进入了全球最畅销药前十名。(3R，5S/R) -6-X-3, 5- 二羟基己酸叔丁酯2 (X=Cl，CN或0R)是合成此类降胆固醇药物的关键手性中间体，可以通过化学法或生物法加以制备。目前国内主要通过化学法生产，化学还原方法的反应条件往往需要低温(如-70 V )，及易燃的硼烷类化合物参与，成本高，纯度低，污染尤其严重，对环境的影响非常大。相比较而言，生物法的反应条件温和，更加实用和环保。 目前生物法主要有酶法和全细胞催化两种。例如美国专利US2008/0248539公开了一种利用来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酮还原酶及其突变株还原法生产(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法利用外源添加的葡萄糖脱氢酶和辅酶因子来维持反应的进行，而且在反应中会产生葡萄糖酸，需用碱维持反应的PH，增加了操作程序，影响反应的原子经济性。国内专利CN 102978249公开了一种酮还原酶生产(3R, 5R)-6-氰基-3，5- 二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法添加的是冻干酶粉，而且添加了价格昂贵的辅酶因子，成本较高，无法进行大规模产业化应用。国内专利CN 102643757公开了利用在土壤中筛选到的季也蒙毕赤酵母菌催化生产(3R，5R)-6-氰基-3，5- 二羟基己酸叔丁酯的方法，但天然菌株全细胞目的酶活低，杂酶种类多，催化存在着效率低，产物纯度不闻等不足。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种反应步骤简单、成本较低、产品纯度高，可大规模生产(3R，5S/R)-6-X-3, 5- 二羟基己酸叔丁酯2 (X=C1，CN或0R)的绿色生物制备方法。 为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案如下:，其特征在于:在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物(5S/R) -6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯I (X=C1，CN或0R)、异丙醇、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25°C?40°C下搅拌反应，利用气相色谱方法(GC)检测反应进程，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R，5S/R) -6-X-3, 5- 二羟基己酸叔丁酯2 (X=C1, CN或0R)。 所述的含有重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的制备方法为:将含有酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD6tltl值达到0.8?1.2时，加入诱导剂，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。 进一步地，所述的诱导剂为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，乳糖等，诱导终浓度为0.2?1.0mM，其中优选异丙基-β -D-硫代半乳糖苷。 进一步地，所述的水相缓冲液浓度为20?200mM，为三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH为6.0?8.0 ;其中更优选三乙醇胺缓冲液，pH6.5?7.5。 所述所述的水相缓冲液为50mM三乙醇胺缓冲液，其配置方法为:称取三乙醇胺7.45g, EDTA 1.48g，加去离子水700ml溶解后，加入浓HCl调pH至7.0，补加去离子水至100ml。 进一步地，反应起始时的反应体系中，底物(5S/R) -6-X-3-羟基_5_羰基己酸叔丁酯1(X=C1，CN或0R)的浓度为10%?30% (w/v)，重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的用量为底物质量的10%?30% (w/w)，异丙醇的浓度为3%?12% (w/v)。根据一个优选方面，反应起始时的反应体系中，底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=C1，CN or OR)的浓度为12%?20% (w/v)，反应中无需添加辅酶因子。 进一步地，在反应体系中加入的Ca2+、Mg2+等二价金属离子，浓度为0.5_20mM，不仅可以增加大肠杆菌细胞的通透性，而且这些离子还是酮还原酶的增强剂。其中更优选Ca2+，根据一个具体方面，所述的反应体系中所用的为CaCl2。 根据本专利技术，所用的底物(5S/R)-6-X_3-羟基_5_羰基己酸叔丁酯I (X=Cl，CN orOR)和其它使用到的原料均可商购获得。此外，本专利技术中所述的酮还原酶(KRED)基因的信息为公知，可通过市售购买获得。他人在实施本专利技术方法时可以按照本专利技术所述方法制备或购买。 由于以上技术方案的实施，本专利技术与已有技术相比具有如下优势:本专利技术方法通过采用特定的重组酮还原酶，解决了传统生物法中催化效率低以及成本高的问题；且该方法反应不需破碎细胞，反应体系无需添加有机溶剂，条件温和，特别是，催化反应过程不用加还原性辅酶因子，降低了生产成本，仅利用细胞本身的辅酶再生体系，反应效率高、步骤少、简便易操作，大大提高了效率和降低了反应的成本，具有广阔的工业生产应用前景。 【专利附图】【附图说明】 图1为重组大肠杆菌催化制备(3R，5S/R)-6-X-3, 5_ 二羟基己酸叔丁酯示意图。 【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细的说明，但本专利技术并不限于以下实施例。 以下实施例的反应缓冲溶液的配制均为:50mM三乙醇胺缓冲液(pH7.0)，称取三乙醇胺7.45g，EDTA 1.48g，加去离子水700ml溶解后，加入浓HCl调pH至7.0，补加去离子水至1000ml。 实施例1重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的制备从转化平板将含有酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养7小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养，培养至0D_值达到 1.0时，加入0.5mM的异丙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物(5S/R)‑6‑X‑3‑羟基‑5‑羰基己酸叔丁酯1、异丙醇、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法检测反应进程，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S/R)‑6‑X‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯2；其中X=Cl,CN 或OR。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈令伟，
申请(专利权)人：南京朗恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32