人用轮状病毒疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了人用轮状病毒疫苗，其为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的缀合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球，载体蛋白之一为轮状病毒蛋白。该人用轮状病毒疫苗的制备方法将多价肺炎球菌多糖与两种或以上的载体蛋白(其一为轮状病毒载体蛋白)分别与磁性纳米微球经偶联而成。本发明专利技术提供的人用轮状病毒疫苗制备工艺简单，采用纳米微球为连接物的人用轮状病毒疫苗能够增强小鼠Th1型免疫应答，以及多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲和性，此外还可诱导小鼠产生轮状病毒抗体；具备两种疫苗的预防效果；因此具有十分广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
人用轮状病毒疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种疫苗，具体说，是涉及人用轮状病毒疫苗疫苗及其制备方法，属于 生物
。
技术介绍
-、微生物对人体的危害及应对措施 微生物通常是指那些个体体积直径一般小于Imm的生物群体，它们结构简单，大 多是单细胞，还有些甚至连细胞结构也没有，我们身边无时无刻不存在着微生物，通常会借 助显微镜或者电子显微镜才能看清它们的形态和结构；其中，致病微生物是指能够引起人 类、动物和植物的病害，具有致病性的微生物。一种病原体的致病性有赖于它的侵袭宿主并 在体内繁殖和抵御宿主抵抗力而不被其消灭的能力。微生物致病性有种属特征，致病能力 强弱的程度称为毒力。感染性疾病的成立并非由微生物的毒力单方面决定，还要视宿主的 健康情况与免疫功能状态。一般而言，毒力强的微生物感染未曾免疫过的机体，能引起病理 损害出现显性感染等，而正常机体却能抵抗许多低毒微生物（如条件致病菌）的损害，但当 宿主抵抗力降低时则可对这些微生物易感而致病。病原体的毒力与宿主抵抗力两者之间的 较量，引出感染性疾病的发生、发展、转归和预后，由于病原体和宿主之间适应程度不同，双 方抗衡的结局各异，产生各种不同的感染谱，即感染过程的不同表现。致病性是对特定宿主 而言，有的只对人类有致病性，有的只对某些动物，而有的则属人畜共患性微生物。而此时 宿主通常只能通过自身的免疫系统来对抗微生物的感染，死亡率非常高，致使各研究学者 研究出了疫苗来对抗致病性微生物对人体的侵害。 而疫苗又分为治疗性和预防性两种，通过治疗性疫苗治疗疾病，并通过预防性疫 苗保护人体不受致病性微生物的侵害。通过接种预防性疫苗来预防疾病是人类在一个多世 纪的临床实践中，证明是行之有效的手段。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的 疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康 水平。生物技术的不断发展，促进了疫苗品种的多样化。今天，用以预防病毒导致的传染病 有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；用减毒病毒 技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、 腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水痘疫苗等。预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生 物大分子纯化技术开发出来的细菌类疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及 其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多糖和23价肺炎球菌多糖等。用基因重组蛋白技术开发 出来的疫苗，如乙肝表面抗原（预防乙型肝炎）、人类乳头状类病毒颗粒病毒（预防子宫颈 癌）等。用半化学结合技术开发出来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌 b型多糖-蛋白结合疫苗、7价或10价肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗以及4价脑膜炎球菌 多糖-蛋白结合疫苗。由此可见，医学生物技术的发展，是疫苗产品不断发展的原动力，通 过对生物技术的不断改进，能够开发出更多的新型疫苗产品来应付不同的传染病对人类健 康的挑战。 二、结合疫苗概述 多糖是病原菌中的一种重要免疫有效成分，有菌体多糖（OPS)和荚膜多糖（CPS) 之分。当病原体侵入机体后，它们作为免疫原，能刺激机体产生保护性免疫应答。但是，多 糖分子属于T细胞不依赖性抗原（Ti-Ag)，免疫原性较弱，接种婴幼儿后免疫效果尤其不 理想，而目前许多危害严重的疾病如流感嗜血杆菌（Hib)引起的脑膜炎、E. Coli 0 157:H7 引起的小儿出血性腹泻脱水等在婴幼儿中高发且临床无有效的治疗办法，病死率高（王燕 等，结合疫苗概述[J]，微生物学免疫学进展，2000, 28(1) :60-63)。为了提高多糖疫苗的 免疫原性，国外于本世纪20年代初兴起了多糖和蛋白的化学结合疫苗，即缀合疫苗，结合 (以蛋白为载体的细菌多糖类）疫苗采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上制备成多 糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血杆菌结合疫 苗、脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗等，短短几十年其发展相当迅速，已取得显著 成果。 三、肺炎球菌的危害及其流行病学研究 由肺炎球菌（肺链）所引起的感染是全世界发病率和死亡率的主要起因。肺炎、 发热性菌血症和脑膜炎是侵入性肺炎球菌性疾病的最常见表现形式，而呼吸道内的细菌扩 散可导致中耳感染、窦炎或复发性支气管炎。与侵入性疾病相比，非侵入性的表现形式通常 不那么严重，但更多见。由于抗生素耐药性传染病的扩散，以及肺炎球菌肺炎经常在流感感 染之后出现，肺炎球菌疾病在流感期间发作的可能性进一步增加。 由肺炎链球菌引发的疾病已成为全球一个重要的公共卫生问题。肺炎球菌已成为 全球儿童的头号杀手。我国肺炎的病死率为16. 4%，其中50岁以上中老年人及1岁以下 婴幼儿分别高达28. 6 %和22. 0%。我国肺炎球菌在健康儿童中的携带率较高，资料统计显 示，在北方地区健康儿童中的携带率为24. 2%，南方地区为31. 3%。而所述病是导致5岁以 下儿童死亡的重要原因。主要原因在于婴幼儿免疫系统的发育尚不完善，免疫力较弱。并 且年龄越小的婴儿，免疫力越弱。肺炎球菌大约有90种血清型（菌株），我国的统计资料 显示肺炎球菌感染菌株前几个血清型依次为：5、6、19、23、14、2、4型。据一项收集了 860株 肺炎球菌分离株的研究显示，有109株（12. 7% )表现为血清群6,在中国肺炎球菌血清型 6的红霉素耐药性达100%，其中的6A、6B和6C型分别为62株（56. 9%)、38株（34. 9% ) 和 9 株（8.2% )。 从化学结构上来看，以上病原体拥有一个细胞表面荚膜多糖（Capsular polysaccharide, CPS)或脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)壳，或者两者兼有，其功能是 帮助病原体感染宿主。荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分免于被宿主免疫系统识 另IJ，防止补体系统被细菌表面蛋白激活和免疫细胞吞噬，如果细菌被吞噬，荚膜多糖能够 防止细菌被杀灭。大多数病原菌中，不同的菌株表达不同结构的荚膜多糖和脂多糖，产生多 种不同的血清型菌株。肺炎球菌所致的肺炎和脑膜炎是由已知的90种血清型中的很大一 部分菌株感染所导致的。 由此可见，大多数细菌多糖类疫苗必需含有多种不同种类的细菌多糖以提高致病 菌株覆盖率，优化和选择包含何种细菌或者血清型多糖在疫苗中是一个非常复杂的流行病 学问题。一旦明确何种多糖抗体具有保护作用，则可用这种多糖作为免疫原来生产疫苗。 中国生物技术集团成都生物制品研究所生产的23价肺炎球菌疫苗是选取了 23种 最常见的致病菌（1，2,3,4,5,6B，7F，8,9N，9V，10A，11A，12F，14,15B，17F，18C，19A，19F，20， 22F，23F，33F)，分别发酵培养并分离提纯肺炎球菌荚膜上的各型多糖，按等比例混合制成 疫苗。细菌的多糖是一种胸腺非依赖性抗原，这种抗原与胸腺依赖性抗原的主要区别在于 前者不需要T淋巴细胞的辅助来产生抗体。临床使用证明，荚膜多糖制作的疫苗明确有效， 并在多个国家广泛使用。但是这类多糖疫苗存在以下问题：（1)在本文档来自技高网...

【技术保护点】
人用轮状病毒疫苗，其特征在于：所述人用轮状病毒疫苗为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的人用轮状病毒疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球，两种或两种以上载体蛋白中的其一为轮状病毒蛋白。

【技术特征摘要】
2014.07.25 CN 201410359131.91. 人用轮状病毒疫苗，其特征在于：所述人用轮状病毒疫苗为多价肺炎球菌多糖与两 种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的人用轮状病毒疫苗，其中，连接体为磁性纳米微 球，两种或两种以上载体蛋白中的其一为轮状病毒蛋白。2. 根据权利要求1所述的人用轮状病毒疫苗，其特征在于：所述磁性纳米微的磁性微 粒位于纳米微球的内部为核，高分子材料包裹于磁性微粒的外部。3. 根据权利要求2所述的人用轮状病毒疫苗，其特征在于：高分子材料为生物高分子 材料，选自壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物 (PELA)中的一种或以上的混合物。4. 根据权利要求1所述的人用轮状病毒疫苗，其特征在于：多价肺炎球菌多糖与两种 载体蛋白的质量比为（0.5?2) :1。5. 根据权利要求1所述的人用轮状病毒疫苗，其特征在于：两种或两种以上载体蛋白 中的另一载体蛋白选自白喉类毒素，破伤风类毒素，载体蛋白CRM197,嗜血流感杆菌表面蛋 白HiD，百日咳Prn表面蛋白，百日...

【专利技术属性】
技术研发人员：李东，鲍路伟，史晋，吴克，
申请(专利权)人：武汉博沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42