卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤干细胞疫苗及其制备和应用。本发明专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗包括：按体积比为3:1:1混合的灭活的卵巢癌干细胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。本发明专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：获得卵巢癌干细胞；将所述卵巢癌干细胞灭活；以及将灭活的卵巢癌干细胞冻融在生理盐水里，与佐剂甘露聚糖肽、脂肪乳混匀，从而获得所述的卵巢癌干细胞疫苗。本发明专利技术提供了根据本发明专利技术所述的制备方法获得的卵巢癌干细胞疫苗用于制备治疗卵巢癌的药物中的用途。本发明专利技术为卵巢癌的治疗及其疫苗的制备提供了一种新的途径，对卵巢癌患者具有积极地治疗效果，可增强患者的免疫功能，对延长患者的生存时间具有积极作用。

【技术实现步骤摘要】
卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物医药工程技术，涉及一种肿瘤干细胞疫苗及其制备和应用。
技术介绍
恶性肿瘤是一种全身性的慢性疾病。在中晚期患者体内，不仅脏器中有影像学检 查时明显的团块肿瘤,在外周血中更有大量看不见的循环肿瘤细胞和肿瘤干细胞（Cancer stem cell，CSC)，随时准备定居在机体易感部位，发育成新的转移灶，这也是肿瘤无法根治 的原因。传统的肿瘤治疗包括4种主要疗法，即手术、化疗、放疗和免疫治疗。通常前三种疗 法治疗3-5年后，肿瘤都会发生周边脏器或远端脏器的转移。随着对CSC研究的深入，人们 已经明确复发和转移的原因不是手术做得不彻底，而是由于缺乏有效的控制、甚至消灭CSC 的方法。 CSC来自人类自体干细胞的恶变，具有低分化度和高扩增性等特点。这些干细胞可 抵抗几乎全部的传统化疗药物及放疗，可在传统治疗的同时即引起肿瘤卵巢复发和转移。 这种现象对于很多免疫治疗也不例外，原因是过去一直使用成熟肿瘤细胞作为抗原供免疫 细胞识别，而CSC不表达这些抗原，可逃避免疫攻击。所以，肿瘤的免疫治疗急需更新观念， 将治疗的主攻方向从成熟肿瘤细胞转变为CSC。 目前国际公认的成熟的寻找CSC的方法是利用ALDEFLUOR/ALDH在人类肿瘤中寻 找。ALDH是所有干细胞中共有的一种酶，在肿瘤干细胞中高或强表达，而在普通干细胞中弱 或无表达。 目前，为了获得肿瘤干细胞（CSC)，人们常通过大量培养普通的肿瘤细胞系，由单 瓶消化扩增至多瓶，再提取出其内的肿瘤干细胞。采用这种方法，其存在很多弊端：获取的 肿瘤干细胞数量有限，普通肿瘤细胞培养花费的人力与财力颇大，长期大量培养各种肿瘤 细胞会需要很多培养试剂、配置专人、容易污染致死，甚至出错；肿瘤干细胞培养存活率低； 培养普通肿瘤细胞因培养瓶或培养箱空间有限，获得的细胞数量也就不多，从中再抽取肿 瘤干细胞，得到的肿瘤干细胞量就更少，远无法满足需求。因此，开发一种操作简单、快捷的 有助于获取高产量的肿瘤干细胞（CSC)的制备方法也是非常有必要的。 近年来，已经有关于肿瘤干细胞疫苗具有抗肿瘤疗效的报道，理论上灭活的肿瘤 干细胞可被直接作为疫苗，但是临床上的疗效很不理想，因此有必要研究和开发适合于临 床应用的肿瘤干细胞疫苗。 卵巢恶性肿瘤（卵巢癌）在女性常见恶性肿瘤中占2. 4%?6. 5%，在女性生殖系 统癌瘤中占第3位，次于宫颈癌和宫体癌。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位， 对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌的病因尚不清楚，其发病可能与年龄、生育、血型、精神因 素及环境等有关。近几年来，由于对宫颈癌及宫体癌的防治，取得了一定的成效，而有关卵 巢癌的防治方面收效相对较小。所以在妇女生殖系统癌瘤中，卵巢癌是造成死亡原因最高 的一种肿瘤。北京市8个医院的材料中，卵巢恶性肿瘤占女性生殖系统恶性肿瘤的22. 9%。 卵巢恶性肿瘤中，不论是国内或国外的资料，均以上皮性癌最为多见。中国恶性生殖细胞肿 瘤的发病率，据几位作者的报道，均比国外发病率高。卵巢癌具有侵袭性和难治愈的特点， 治疗后仍有可能复发或转移。而其起源、复发与转移的真正原因可能是存在于卵巢癌内极 少数具有干细胞的自我更新能力和多向分化潜能的细胞群，即卵巢癌干细胞，这些细胞具 有化疗、放疗及缺氧抵抗性，同时具有高致瘤性、高侵袭转移性，在卵巢癌的发生、发展乃 至转移、复发中起着极其重要作用。然而，放疗和化疗对存在于肿瘤中数量较少的干细胞 样细胞群疗效甚微，经过治疗后残存的卵巢癌干细胞的增殖足以促使卵巢癌复发和转移之 一。目前尚缺乏有效的卵巢癌干细胞疫苗，本领域技术人员在这方面亟待取得突破。
技术实现思路
本专利技术的第一个方面是提供一种卵巢癌干细胞疫苗，对卵巢癌患者具有积极地治 疗效果，可增强患者的免疫功能。 本专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗包括：按体积比为3:1:1混合的灭活的卵巢癌干 细胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。 本专利技术的第二个方面提供一种卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，可实现简单、快捷 地获取高产量、易于质量控制的卵巢癌干细胞，并制备出临床上有效的卵巢癌干细胞疫苗。 本专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：获得卵巢癌干细胞； 将所述卵巢癌干细胞灭活；将灭活的卵巢癌干细胞冻融在生理盐水里，与佐剂甘露聚糖肽、 脂肪乳混匀，从而获得所述的卵巢癌干细胞疫苗。 根据本专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述灭活包括： 将卵巢癌干细胞由-80°c至20°C反复冻融五次致死。 根据本专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述卵巢癌干细 胞、甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例为3:1:1 (体积比）。 根据本专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述的卵巢癌干 细胞是⑶133阳性卵巢癌干细胞。 根据本专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述的CD133阳 性卵巢癌干细胞是通过以下步骤制备的： A.将液氮或_80°C保存的卵巢癌细胞于37°C水浴，快速溶化； B.用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培养基混匀已融化的卵巢癌细胞悬液，于 1500转/分，离心8分钟； C.弃上清，再吸取8. Oml培养基质混匀细胞沉淀，再1500转/分，离心8分钟，弃 上清，细胞沉淀用I. Oml培养基混匀，备用； D.另取一个75cm2方瓶，加入14. Oml培养基质，将I. Oml上述制备的含卵巢癌细 胞悬液加入此方瓶中，于37°C，5% CO2孵育箱中培养； E.卵巢癌细胞呈贴壁生长，经过3-4天，卵巢癌细胞生长至80%-95%单层时，弃 上清，用0. 5mM的EDTA，处理卵巢癌细胞大约3-5分钟，用倒置显微镜观察，当90 %的卵巢 癌细胞变圆时，即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml离心管中，于1500转/分下， 离心8分钟，弃上清，计数，若细胞数不足，扩增至三个培养瓶，继续消化离心； F.加入缓冲液重悬细胞，采用⑶133免疫磁珠分选系统从细胞液中分选出⑶133 阳性卵巢癌干细胞； G.将前一步骤获得的⑶133阳性卵巢癌干细胞在DMEM/F12培养液中进行培养； H. 37°C、5% CO2孵育箱中培养5-7天，从而获得足够用于制备卵巢癌干细胞疫苗 的⑶133阳性卵巢癌干细胞。 根据本专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述步骤E中， 在加入EDTA的同时加入0. 25%胰酶I. Oml以消化肿瘤细胞。 根据本专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述步骤G中， 在DMEM/F12培养液中添加：生长因子rhEGF 15?25ng/ml、rhbFGF 5?15ng/ml、硫酸卵巢 素2?6ug/ml、胎牛血清0· 1?0.2% (质量百分比）和青霉素-链霉素双抗0.5?1.5% (质量百分比）。 根据本专利技术所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述步骤H中， 所述足够用于制备卵巢癌干细胞疫苗的CD133阳性卵巢癌干细胞是培养至细胞个数达到 IXlO5?5X105/ml的CD13本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卵巢癌干细胞疫苗，其特征在于，包括：按体积比为3:1:1混合的灭活的卵巢癌干细胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。

【技术特征摘要】
1. 一种卵巢癌干细胞疫苗，其特征在于，包括：按体积比为3:1:1混合的灭活的卵巢癌 干细胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。2. -种卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 获得卵巢癌干细胞； 将所述卵巢癌干细胞灭活；以及 将灭活的卵巢癌干细胞冻融在生理盐水里，与佐剂甘露聚糖肽、脂肪乳混匀，从而获得 所述的卵巢癌干细胞疫苗。3. 根据权利要求2所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述灭活包括： 将卵巢癌干细胞由-80°C至20°C反复冻融五次致死。4. 根据权利要求2所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于：所述卵巢癌干 细胞、甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例为3:1:1 (体积比）。5. 根据权利要求2所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于：所述的卵巢癌 干细胞是⑶133阳性卵巢癌干细胞。6. 根据权利要求5所述的卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述的CD133阳 性卵巢癌干细胞是通过以下步骤制备的： A. 将液氮或_80°C保存的卵巢癌细胞于37°C水浴，快速溶化； B. 用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培养基混匀已融化的卵巢癌细胞悬液，于1500 转/分，离心8分钟； C. 弃上清，再吸取8. 0ml培养基质混匀细胞沉淀，再1500转/分，离心8分钟，弃上清， 细胞沉淀用1. 〇ml培养基混匀，备用； D. 另取一个75cm2方瓶，加入14. 0ml培养基质，将1. 0ml上述制备的含卵巢癌细胞悬 液加入此方瓶中，于37°C，5% 0)2孵育箱中培养； E. 卵巢癌细胞呈贴壁生长，经过3-4天，卵巢癌细...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈继冰，林茂，左建生，刘建国，徐克成，牛立志，
申请(专利权)人：广州复大医疗股份有限公司复大肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：广东;44