猪痢疾短螺旋体的基因和蛋白质及其用途制造技术

本发明专利技术描述了新的猪痢疾短螺旋体的多核苷酸和氨基酸。这些序列可以用于诊断动物中的猪痢疾短螺旋体疾病，和在动物中治疗或预防猪痢疾短螺旋体疾病。这些序列还可以用于诊断以及治疗和/或预防动物中由其他短螺旋体属物种，包括B.intermedia、B.suanatina、B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens、B.murdochii和毛肠短螺旋体，引起的疾病。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2007年8月3日的、专利技术名称为“猪痢疾短螺旋体的基因和蛋白质及其用途”的中国专利申请200780100937.4(PCT/EP2007/058049)的分案申请。专利
本专利技术涉及猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae）中的新基因和其中编码的蛋白质。本专利技术进一步涉及这些新基因和蛋白质用于诊断猪痢疾短螺旋体疾病、用于抗猪痢疾短螺旋体疫苗和用于筛选杀死猪痢疾短螺旋体或阻断猪痢疾短螺旋体的致病效应的化合物的用途。这些序列还可以用于诊断以及治疗和/或预防动物中由其他短螺旋体属物种引起的疾病，所述其他短螺旋体属物种包括B.suanatina、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens、B.murdochii和毛肠短螺旋体（B.pilosicoli）。专利技术背景猪痢疾是澳大利亚和全世界显著的猪地方病。猪痢疾是接触传染性粘膜出血性（mucohaemorrhagic）腹泻疾病，特征为大肠上皮表面的广泛炎症和坏死。由猪痢疾引起的经济损失主要来自于生长迟缓、药疗成本和死亡率。猪痢疾的致病因子在1971年首先被鉴定为厌氧螺旋体（猪痢疾密螺旋体（Treponema hyodysenteriae）），近来被重新分至短螺旋体属为猪痢疾短螺旋体。当猪痢疾在猪舍中建立后，疾病谱可以从轻微、暂时或不明显到严重和甚至致命之间变化。对单个猪舍的药物策略可以掩蔽临床征象，并且在某些猪舍疾病可以变得不被注意或可能仅被怀疑。无论明显疾病是否发生，猪痢疾短螺旋体都可以在受感染猪中、或在其他储存宿主例如啮齿类动物中或在环境中持续存在。所有这些来源均造成疾病向未感染猪群传播的可能性。商业家禽也可以被猪痢疾短螺旋体定居，尽管不清楚这在自然条件下的发生频率如何。猪痢疾短螺旋体的建群将引发针对该螺旋体的强免疫应答，因此暴露于该螺旋体的间接证据可以通过测量受感染动物血液中的循环抗体滴度来获得。已报告这些抗体滴度维持在低水平，甚至在已从猪痢疾康复的动物中。用于检测抗体的血清学试验因此具有检测亚临床感染和康复的猪携带者的显著潜力，所述猪在其大肠中具有不能检测到的螺旋体数量。这些试验以容易使用试剂盒形式例如酶联免疫吸附测定法，而是特别有价值的。已开发了各种技术来检测针对猪痢疾短螺旋体的循环抗体的存在，包括间接荧光抗体试验、血凝集试验、微量滴定凝集试验、补体固定试验和使用脂多糖或超声处理的全螺旋体作为抗原的ELISA。所有这些试验都遇到特异性的问题，因为相关的非致病性肠道螺旋体可以诱导交叉反应性抗体。这些试验对于检测存在明显疾病和高循环抗体滴度的猪群是有用的，但它们对于鉴定亚临床感染的群体和单个受感染的猪是有问题的。因此，迄今为止，尚无十分灵敏和特异的测定法可用于检测针对猪痢疾短螺旋体的抗体。缺乏合适的诊断试验已阻碍了对猪痢疾的控制。许多方法被用于控制猪痢疾，从抗微生物剂的预防性使用，到受感染群体的完全转移和防止受感染的猪携带者的再进入。所有这些供选手段都是昂贵的，并且它们需要使用复杂的诊断试验监控进程，才能完全有效。目前，在具有亚临床感染的兽群和单个健康动物携带者中检测猪痢疾仍是主要的问题，其正在阻碍有效控制措施的执行。传统上，猪痢疾的确诊需要从患病猪的粪便或粘膜分离和鉴定猪痢疾短螺旋体。涉及的主要问题包括这些厌氧细菌的缓慢生长和苛刻的营养需求，以及由猪肠道正常菌群中存在的形态学相似螺旋体造成的混淆。随着用于自粪便检测螺旋体的聚合酶链反应（PCR）测定法的开发，在受累猪个体的诊断方面获得了显著改善。不幸的是，在实际应用中，PCRs的检测极限使得它无法检测具有亚临床感染的动物携带者。由于这些诊断问题，存在着开发能够在群体和猪个体水平上检测猪痢疾短螺旋体感染的简单和有效诊断工具的明确需要。在猪痢疾短螺旋体建群后将诱导针对该螺旋体的强免疫应答，该免疫应答可以防止自猪痢疾康复的猪再次感染。尽管如此，开发疫苗控制猪痢疾的尝试一直仅有非常有限的成功，这是因为它们不能在群体基础上提供充足的保护，或它们太昂贵和难以生产从而使得它们无法商业化。菌苗疫苗可以提供一定水平的保护，但它们倾向于是脂多糖血清型特异的，这就要求使用多价菌苗。此外，因为该螺旋体的苛刻厌氧生长需求，它们的大规模生产是困难且昂贵的。已进行开发减毒活疫苗用于猪痢疾的几种尝试。这种方法具有减毒株显示减少的建群和因此引起减少的免疫刺激的缺点。此外，因为回复毒力的可能性，部分生产者和兽医不愿使用活疫苗用于猪痢疾，特别是在对猪痢疾短螺旋体的遗传调节和组构知之甚少的情况下。重组亚单位疫苗的使用是吸引人的备选方法，因为该产品将是成分明确的（对于注册目的而言是必需的），并且相对容易大规模生产。迄今为止，首个报告的猪痢疾短螺旋体重组蛋白质作为疫苗候选物（38千道尔顿鞭毛蛋白质）的使用未能阻止猪中的建群。这种失败可能与使用的具体重组蛋白质，以及递送系统和途径、剂量率、佐剂选择等其他更下游的问题特别相关（Gabe，JD，Chang，RJ，Slomiany，R，Andrews，WH和McCaman，MT（1995）Isolation of extracytoplasmic proteins from Serpulina hyodysenteriae B204and molecular cloning of the flaB1gene encoding a 38-kilodalton flagellar protein.Infection and Immunity63:142-148）。首个报告的用于疫苗接种的部分保护性重组猪痢疾短螺旋体蛋白质是29.7kDa外膜脂蛋白（Bhlp29.7，也称为BmpB和BlpA），其与各种致病菌的甲硫氨酸结合性脂蛋白具有同源性。用his标记的重组Bhlp29.7蛋白质接种猪，随后用猪痢疾短螺旋体进行实验性攻击，与50-70％的未接种对照猪发病比较，导致17-40％的疫苗接种猪发病。因为Bhlp29.7接种的猪的疾病发生率明显（P=0.047）低于对照猪，所以Bhlp29.7看起来具有作为猪痢疾疫苗组分的潜力（La，T，Phillips，ND，Reichel，MP和Hampson，DJ（2004）.Protection of pigs from swine dysentery by vaccination with recombinant BmpB，a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多核苷酸，其包括选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、
17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、
49、51、53、55、57、59、61、63和65的序列。
2.质粒，其包含权利要求1的多核苷酸。
3.权利要求2的质粒，其中所述质粒是表达载体。
4.细胞，其包含权利要求2的质粒。
5.细胞，其包含权利要求3的质粒。
6.免疫原性组合物，其包括权利要求3的质粒。
7.用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体的疫苗组合物，其包括权利要求3
的表达载体。
8.用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体的疫苗组合物，其包括权利要求4
的细胞。
9.DNA分子，其包括与权利要求1的多核苷酸具有至少70％同一性
的序列。
10.质粒，其包括权利要求9的多核苷酸。
11.权利要求9的DNA分子，其中所述DNA分子与权利要求1的多
核苷酸具有至少80％同一性。
12.质粒，其包含权利要求11的多核苷酸。
13.权利要求9的DNA分子，其中所述DNA分子与权利要求1的多
核苷酸具有至少90％同一性。
14.质粒，其包含权利要求13的多核苷酸。
15.多肽，其包括选自SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、
18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、
50、52、54、56、58、60、62、64和66的序列。
16.多核苷酸，其包括编码权利要求15的多肽的序列。
17.质粒，其包含权利要求16的多核苷酸。
18.权利要求17的质粒，其中所述质粒是表达载体。
19.细胞，其包含权利要求17的质粒。
20.免疫原性组合物，其包括权利要求19的细胞。
21.蛋白质，其包括与权利要求15的多肽具有至少70％同源性的序
列。
22.权利要求21的蛋白质，其中所述蛋白质与权利要求15的多肽具
有至少80％同源性。
23.权利要求22的蛋白质，其中所述蛋白质与权利要求15的多肽具
有至少90％同源性。
24.免疫原性组合物，其包括权利要求23的蛋白质。
25.免疫原性组合物，其包括权利要求15的多肽。
26.用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体的疫苗组合物，其包括权...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·贝尔伽德，D·J·汉普森，T·拉，
申请(专利权)人：贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司，
类型：发明
国别省市：