基于核壳量子点柔性偶联标记物免疫层析试纸条的检测方法技术

本发明专利技术提供一种基于核壳量子点柔性偶联标记物免疫层析试纸条的检测方法，属于免疫检测方法技术领域。该方法利用核壳量子点具有激发谱线宽、发射谱线窄、量子尺寸效应、荧光量子效率高、光化学稳定性强的特性的基础上，采用EDC缩合的方式将量子点与蛋白G或蛋白A分子进行共价连接，利用蛋白G或蛋白A分子做桥，依靠其与抗体Fc端的特异性，实现量子点与抗体分子的柔性偶联，不占据抗体的抗原决定簇部位，大大提高抗体的抗原免疫活性，利用该标记产物进行免疫检测的灵敏度和特异性都得到极大的提高。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种，属于免疫检测方法
。该方法利用核壳量子点具有激发谱线宽、发射谱线窄、量子尺寸效应、荧光量子效率高、光化学稳定性强的特性的基础上，采用EDC缩合的方式将量子点与蛋白G或蛋白A分子进行共价连接，利用蛋白G或蛋白A分子做桥，依靠其与抗体Fc端的特异性，实现量子点与抗体分子的柔性偶联，不占据抗体的抗原决定簇部位，大大提高抗体的抗原免疫活性，利用该标记产物进行免疫检测的灵敏度和特异性都得到极大的提高。【专利说明】
本专利技术属于免疫检测方法
，具体涉及。
技术介绍
目前利用纳米金显色的检测试纸条已被大量应用，其基本原理是以微孔膜为固相载体，包被检测物的抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜的毛细管虹吸作用使样本中检测物与膜上包被的抗原或抗体结合，通过纳米金标记物自身的颜色判定检测结果。但是对于某些含量较低的样本，纳米金的颜色很浅，难于用肉眼来判断结果，灵敏度低，只能定性检测，不能定量分析。由于量子点具有激发谱线宽、发射谱线窄、量子尺寸效应、高荧光效率、强光化学稳定性等特性，可以替代胶体纳米金进行生物标记，用高灵敏的荧光信号代替吸收显色进行检测。量子点试纸条既可以进行定性分析，又可以进行定量检测。经对现有技术的专利检索发现，中国专利申请号200610024086.7的专利，利用量子点的特性，专利技术了一种量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，对待检测物进行定性或半定量检测，该专利技术通过改变量子点的粒径或种类，得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同的抗体，通过多色荧光信号进行多组分的检测，方法简单快速，成本低。然而量子点是一种纳米材料，具有极大的表面效应，现有的利用量子点检测的试纸条都是将量子点与抗体分子通过静电吸附作用、直接共价连接等方式进行生物标记，在标记抗体的过程中，很容易标记到抗体的具有抗原决定簇部位的Fab端，标记后的抗体不能与抗原分子进行免疫反应，因而是一种无效的标记，这种直接连接技术对于最终的免疫检测的灵敏度，尤其是特异性会有很大程度的影响，降低检测效果，定量检测灵敏度和特异性都无法达到满意结果。而且现有的量子点试纸条专利都是利用裸核量子点进行免疫检测，由于裸核量子点较核壳量子点的荧光特性会有很大的减弱，因而将其应用到试纸条免疫检测，效果一定弱于用核壳量子点进行免疫检测的结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种，该检测方法具有较高的灵敏度和特异性。本专利技术提供一种，包括如下:步骤一:制备核壳量子点；步骤二:将步骤一得到的核壳量子点与蛋白G或蛋白A通过EDC缩合的方式进行共价连接，得到共价连接产物；步骤三:将步骤二得到的共价连接产物与待检测抗原分子的一个抗体分子混合，得到量子点抗体柔性偶联的标记产物；步骤四:将步骤三得到的量子点抗体柔性偶联的标记产物涂在玻璃纤维素膜上，得到涂有标记产物的玻璃纤维素膜，将待检测抗原分子的另一个抗体和二抗分别喷涂在硝酸纤维素膜上形成测试带和控制带，得到已平行包被抗体的硝酸纤维素膜；步骤五:在单面聚酯或塑料板上，依次粘贴上玻璃纤维素滤膜、涂有标记产物的玻璃纤维素膜、吸水纤维素膜、已平行包被抗体的硝酸纤维素膜，将粘贴后的聚酯或塑料板制作得到免疫层析试纸条；步骤六:将步骤五得到的免疫层析试纸条的垫端插入待测样品溶液中，免疫层析后取出试纸条，确定检测结果。优选的是，所述的核壳量子点为CdTe/CdS、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe或CdSe/ZnS核壳量子点。优选的是，所述的共价连接产物与待检测抗原分子的一个抗体分子的摩尔比为1:1o优选的是，所述的步骤四中，测试带和控制带平行设置，测试带和控制带的间隔为8-12mm。优选的是，所述的将待检测抗原分子的另一个抗体和二抗分别喷涂在硝酸纤维素膜上形成测试带和控制带后，室温晾干20-30分钟后，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60-120分钟，干燥后封袋，放置4°C保存备用。优选的是，所述的待测样品溶液为血液、尿液或唾液。优选的是，所述的步骤六中，免疫层析后取出试纸条后，具体为:将试纸条在紫外灯下肉眼观察结果，或在荧光光谱仪下获得检测光谱曲线，通过与标准曲线对比，确定检测结果。本专利技术的有益效果1、本专利技术提供一种，该方法利用核壳量子点具有激发谱线宽、发射谱线窄、量子尺寸效应、荧光量子效率高、光化学稳定性强的特性的基础上，采用EDC缩合的方式将量子点与蛋白G或蛋白A分子进行共价连接，利用蛋白G或蛋白A分子做桥，依靠其与多数哺乳动物(包括人、羊、兔、鼠、马、猪、猴等)的抗体Fe端的特异性，实现量子点与抗体分子的柔性偶联，不占据抗体的抗原决定簇部位，大大提高抗体的抗原免疫活性，利用该标记产物进行免疫检测的灵敏度和特异性都得到极大的提高；2、本专利技术将得到的量子点抗体柔性偶联的标记产物涂在玻璃纤维素膜上，将待检测抗原分子的另一个抗体和二抗分别喷涂在硝酸纤维素膜上形成测试带和控制带，利用双抗体夹心法原理结合量子点的柔性标记技术及其荧光性质检测样品中是否含有目标抗原分子。通过测试免疫层析试纸条上测试带与控制带的荧光光谱，定性或定量判断检测结果;3、本专利技术通过用不同粒径大小的量子点标记不同的抗体分子，就可得到不同波长的荧光，用不同尺寸大小的量子点柔性偶联不同的抗体分子，可产生多色荧光，实现多组分的检测，测试带只需要一条即可，不需要多条测试带，实验操作简单快捷；4、本专利技术将柔性偶联标记技术的高灵敏高特异性、免疫反应的高特异性与量子点的高效荧光特性三者相结合，该检测方法简便、灵敏，适用于血样、尿样、唾液等样本，可应 用于食品安全、环境监测、医疗诊断、卫生防疫等众多领域。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术利用蛋白G实现核壳量子点与抗体分子的柔性偶联的示意图；图2为本专利技术量子点试纸条检测原理示意图。【具体实施方式】本专利技术步骤一所述的核壳量子点的制备方法为现有技术，该方法利用连续离子层吸附反应技术(SILAR)实现量子点的核壳包覆。采取一锅法原理，在同一反应装置中加入核原料，通过控制核生长的时间获得不同粒径大小的裸核量子点，然后再逐滴加入壳原料，利用SILAR技术进行壳层包覆，最后离心纯化处理样品获得核壳量子点，具体方法参见文章 J.Phys.Chem.C2008, 112，8587 - 8593。本专利技术所述的核壳量子点优选为CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS等核壳量子点，通过改变量子点的粒子大小，可以实现荧光颜色的调谐，更优选采用裸核尺寸小于3nm的绿光量子点(荧光发射波段在500-560nm)、3-4nm (荧光发射波段在560_590nm)的黄光量子点、大于4nm(荧光发射波段在590-650nm)的红光量子点进行试纸条的免疫检测。以CdTe/CdS核壳量子点为例，具体方法为:1、在蒸馏水中加入碲粉和硼氢化钠，得到碲氢化钠的溶液，所述的蒸馏水为用氮气充分除氧的蒸馏水，碲粉和硼氢化钠的摩尔比为1:5 ；2、称取六水合高氯酸镉，加入到含有无氧水的三颈瓶中，再加入巯基丙酸，用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值在10-11之间；所述的六水合高氯酸镉和巯基丙酸的摩尔比为1:2.4 ;3、将I得到的碲氢化钠的溶液加入步骤二的三颈瓶中，升温至100°C，合成Cd本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾庆辉，纪文宇，
申请(专利权)人：中国科学院长春光学精密机械与物理研究所，
类型：发明
国别省市：