用于治疗表达密蛋白6之癌症的抗体制造技术

本发明专利技术提供可用作治疗剂的抗体，其用于治疗和/或预防与表达CLDN6之细胞相关的疾病，包括肿瘤相关的疾病，例如卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌和子宫癌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗表达密蛋白6之癌症的抗体在过去的十年间，抗体已被成功地引入临床用于癌症治疗，并且已成为肿瘤学中最有希望的疗法。与常规药物相比，基于抗体的癌症治疗具有较高特异性和较低副作用谱的潜力。原因是抗体在正常和肿瘤细胞之间的精确区分，及其作用方式依赖毒性较小的免疫抗肿瘤机制(例如，补体激活和募集细胞毒性免疫细胞)的事实。密蛋白(claudin)是位于上皮与内皮的紧密连接内的整合膜蛋白(integralmembraneprotein)。预测密蛋白具有四个跨膜区段，有两个细胞外环，并且N和C末端位于胞质中。跨膜蛋白质的密蛋白(CLDN)家族在上皮与内皮紧密连接的维持中发挥关键作用，并且还可能在细胞骨架的维持中以及在细胞信号传导中发挥作用。除了它们的膜定位之外，这些蛋白质在肿瘤和正常细胞之间的差异表达使它们成为有吸引力的癌症免疫治疗靶标，并且在癌症治疗中使用靶向CLDN的基于抗体的治疗剂(therapeutics)使高水平的治疗特异性成为可能。然而，靶向CLDN之治疗剂的临床应用面临多种障碍。身体中普遍存在的CLDN表达以及CLDN在维持紧密连接中的关键作用要求靶向CLDN之治疗剂的靶标特异性，以使治疗特异性最大化以及全身毒性最小化。WO2009/087978涉及抗CLDN6抗体，并且涉及其作为抗癌剂的应用。特别是描述了所设计的单克隆抗体AB3-1、AE1-16、AE49-11和AE3-20。然而，通过实施例5中的FACS分析表明，这些抗体都不是CLDN6特异性的。抗体AE3-20与CLDN9反应，而抗体AE1-16和AE49-11表现出与CLDN9相当大的反应性，并且还与CLDN4反应。抗体AB3-1与CLDN6的结合与其与CLDN9的结合一样强。实施例7中描述了当向小鼠肿瘤模型施用时，抗体AE49-11倾向于抑制肿瘤生长，并且具有延长生命的作用。然而，鉴于所使用抗体的非特异性，还不清楚所描述的作用是否是由抗体与CLDN6结合所引起的。因此，到目前为止，尚未描述与表达CLDN6之细胞的表面选择性结合的CLDN6特异性的抗体。然而，需要这样的特异性抗体用于使用CLDN6作为靶标的基于抗体的治疗方法。图1中所示的CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9的序列比对说明CLDN6与其他密蛋白有高度的保守性。CLDN6与其他密蛋白(特别是CLDN9和CLDN4)的这种高同源性以及WO2009/087978无法提供CLDN6特异性抗体的事实表明也许不能产生与CLDN6特异性结合的抗体。专利技术概述本文中公开的实验结果确证CLDN6在不同的人癌细胞中表达，而在正常组织中的表达限于胎盘。此外，本专利技术第一次描述成功地产生能够与表达CLDN6之完整细胞的表面相结合的CLDN6特异性抗体。表达CLDN6之完整细胞的FACS分析显示抗CLDN6抗体的特异性结合，而对于表达其他密蛋白(特别是CLDN3、CLDN4和CLDN9)的细胞或者不表达任何这些CLDN蛋白的细胞未观察到结合。因此，本专利技术出人意料地证明，可产生这样的抗体，其与表达CLDN6之细胞表面上的CLDN6特异性地进行抗原-抗体反应，但基本不与其他高度同源性的密蛋白进行抗原-抗体反应。本专利技术一般地提供可用作治疗剂的抗体，其用于治疗和/或预防与表达CLDN6并以CLDN6与细胞表面相缔合(association)为特征之细胞相关的疾病，包括肿瘤相关的疾病，特别是癌症，例如卵巢癌(特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌(特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌)、恶性黑色素瘤、头颈癌(特别是恶性多形性腺瘤)、肉瘤(特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、胆管癌、膀胱癌(特别是移行细胞癌和乳头状癌)、肾癌(特别是肾细胞癌，包括明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌)、结肠癌、小肠癌(包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌)、睾丸胚胎性癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌(特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎性睾丸癌)、子宫癌、生殖细胞肿瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤)、及其转移形式。在一个方面中，本专利技术涉及能够与表达CLDN6之细胞表面所缔合的CLDN6相结合的抗体。优选地，所述抗体基本不能与表达CLDN9之细胞表面相缔合的CLDN9相结合。优选地，所述抗体基本不能与表达CLDN4之细胞表面所缔合的CLDN4相结合和/或基本不能与表达CLDN3之细胞表面所缔合的CLDN3相结合。最优选地，所述抗体基本不能与CLDN6以外的其他CLDN蛋白(所述其他CLDN蛋白与表达所述CLDN蛋白之细胞表面相缔合)相结合，并且是CLDN6特异性的。优选地，表达所述CLDN蛋白的所述细胞是完整细胞，特别是非透化的细胞，并且与细胞表面相缔合的所述CLDN蛋白具有天然的(即非变性的)构象。优选地，所述抗体能够与一个或更多个天然构象的CLDN6表位相结合。在一个实施方案中，所述抗体能够与位于CLDN6的胞外部分中的表位相结合，其中CLDN6的所述胞外部分优选地包含SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：14和SEQIDNO：15的任一氨基酸序列，优选SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列，更优选SEQIDNO：6的氨基酸序列。优选地，所述抗体能够与位于SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：14和SEQIDNO：15的任一氨基酸序列(优选SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列)中的表位相结合。在一个实施方案中，所述抗体能够通过如下与CLDN6结合：通过至少与选自Thr33、Phe35、Gly37、Ser39、Ile40和Leu151的一个、优选超过一个(例如，2、3、4或5个)、优选全部氨基酸相互作用，优选通过至少与选自Thr33、Phe35、Gly37、Ser39和Ile40的一个、优选超过一个、优选全部氨基酸相互作用，更优选通过至少与选自Phe35、Gly37、Ser39和Ile40或者Thr33、Phe35、Gly37和Ser39的一个、优选超过一个、优选全部氨基酸相互作用，并且特别是通过至少与选自Phe35、Gly37和Ser39的一个、优选超过一个、优选全部氨基酸相互作用。优选地，所述抗体不与选自Glu154、Ala155、Arg158和Gly161的一个或更多个、优选全部氨基酸相互作用，并且优选不与选自Arg158和Gly161的一个或更多个、优选全部氨基酸相互作用。可通过丙氨酸扫描氨基酸的突变来分析抗体与CLDN6(特别是天然构象CLDN6)之间的相互作用。可评价CLDN6突变体被特异性单克隆抗体所结合的能力。特异性单克隆抗体与CLDN6突变体之结合受损表明被突变的氨基酸是重要的接触残基。可例如通过流式细胞术分析结合。在一个实施方案中，通过包括以下步骤的方法可获得所述抗体：用具有SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：14和SEQIDNO：15的任一氨基酸序列(优选SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列)本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗体，其包含：(i)抗体重链，所述抗体重链包含选自SEQ ID NO：34、36、38和40的抗体重链序列或其变体，优选SEQ ID NO：36的抗体重链序列或其变体，以及(ii)抗体轻链，所述抗体轻链包含选自SEQ ID NO：35、37、39、41、54和55的抗体轻链序列或其变体，优选SEQ ID NO：35的抗体轻链序列或其变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.13 EP 11004004.5;2011.05.13 US 61/486,0711.抗体，其包含：(i)抗体重链，其中所述抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区，其中所述抗体重链可变区表示为SEQIDNO:34的抗体重链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体重链可变区的人源化或嵌合形式，以及抗体轻链，其中所述抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链可变区表示为SEQIDNO:35的抗体轻链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体轻链可变区的人源化或嵌合形式；(ii)抗体重链，其中所述抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区，其中所述抗体重链可变区表示为SEQIDNO:36的抗体重链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体重链可变区的人源化或嵌合形式，以及抗体轻链，其中所述抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链可变区表示为SEQIDNO:37的抗体轻链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体轻链可变区的人源化或嵌合形式；(iii)抗体重链，其中所述抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区，其中所述抗体重链可变区表示为SEQIDNO:38的抗体重链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体重链可变区的人源化或嵌合形式，以及抗体轻链，其中所述抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链可变区表示为SEQIDNO:39的抗体轻链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体轻链可变区的人源化或嵌合形式；(iv)抗体重链，其中所述抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区，其中所述抗体重链可变区表示为SEQIDNO:40的抗体重链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体重链可变区的人源化或嵌合形式，以及抗体轻链，其中所述抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链可变区表示为SEQIDNO:41的抗体轻链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体轻链可变区的人源化或嵌合形式；或者(v)抗体重链，其中所述抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区，其中所述抗体重链可变区表示为SEQIDNO:36的抗体重链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体重链可变区的人源化或嵌合形式，以及抗体轻链，其中所述抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链可变区表示为选自SEQIDNO:35、54和55的抗体轻链可变区序列或其变体，其中所述变体是所述抗体轻链可变区的人源化或嵌合形式。2.权利要求1的抗体，其能够与表达CLDN6之细胞表面所缔合的CLDN6相结合并且不能与表达CLDN9之细胞表面所缔合的CLDN9可检测地相结合。3.权利要求1或2的抗体，其不能与表达CLDN4之细胞表面所缔合的CLDN4可检测地相结合和/或不能与表达CLDN3之细胞表面所缔合的CLDN3可检测地相结合。4.权利要求1或2的抗体，其是CLDN6特异性的。5.权利要求2的抗体，其中所述细胞是完整细胞。6.权利要求5的抗体，其中所述细胞是非透化细胞。7.权利要求1或2的抗体，其能够与位于CLDN6的胞外部分中的表位相结合。8.权利要求2的抗体，其中CLDN6表示为SEQIDNO:2的氨基酸序列或SEQIDNO:8的氨基酸序列。9.权利要求1或2的抗体，其具有以下活性中的一种或更多种：(i)杀伤表达CLDN6的细胞，(ii)抑制表达CLDN6之细胞的增殖，(iii)抑制表达CLDN6之细胞的集落形成，(iv)介导已建立之肿瘤的缓解，(v)预防肿瘤的形成或再形成，和(vi)抑制表达CLDN6之细胞的转移。10.权利要求1或2的抗体，其表现出一种或更多种针对带有天然构象CLDN6之细胞的免疫效应功能。11.权利要求10的抗体，其中所述一种或更多种免疫效应功能选自：补体依赖的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、诱导凋亡、以及抑制增殖。12.权利要求10的抗体，其中所述一种或更多种免疫效应功能是ADCC和/或CDC。13.权利要求9的抗体，其中所述一种或更多种活性是通过所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌尔·沙欣，厄兹莱姆·图雷奇，米夏埃尔·科斯洛夫斯基，科登·沃尔特，斯特凡·韦尔，玛丽亚·克罗伊茨贝格，贝恩德·胡布纳，米夏埃尔·埃尔代连，米夏埃尔·魏歇尔，
申请(专利权)人：加尼梅德药物公司， 约翰内斯·古滕伯格美因兹大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE