本发明专利技术涉及一种重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂，其含有重组腺相关病毒AAV-shCdc6；所述重组腺相关病毒AAV-shCdc6是将特异性人Cdc6RNAi靶向序列的小分子干扰RNA(siRNA)插入AAV的特异位点后得到的。本发明专利技术的重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂可以高效感染乳腺癌细胞，并持续表达特异靶向Cdc6的siRNA，最终能够特异性杀伤乳腺癌细胞，相反对正常乳腺上皮细胞没有杀伤作用。因此，重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂可以作为治疗乳腺癌的新型生物制剂。
【技术实现步骤摘要】
重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂、其制备和应用
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种重组腺相关病毒制剂、其制备方法和应用。
技术介绍
全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有I人忠乳腺癌。近年我国乳腺癌发病率的增长速度高出高发国家I~2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示:全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第I位，女性乳腺癌发病率(粗率)全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。近年来，乳腺肿瘤治疗虽然取得一定进展，但整体效果欠佳，病死率仍居高不下，原因在于现阶段人们根据对乳腺癌发生发展机制的认识和指定的癌症治疗方案仍欠缺特异性和高效性。大多数癌症治疗方案导致非特异性治疗副作用的产生，对患者造成不同程度的伤害，甚至引起生命危险。因此，在我国经济飞速发展、人民健康水平空前提高的情况下，对乳腺癌特异性治疗的研究有了更大的社会需求，也是我国持续发展和建设和谐社会的重要任务之一。目前，分子靶向药物是抗肿瘤新药研发的主要方向。但是，肿瘤的靶向治疗面临巨大挑战，主要是缺乏特异性杀伤肿瘤细胞的有效药物靶点。为解决这个难题，必须系统地理解肿瘤发生发展调控的相关机制，找出可以作为药物靶点的重要调控分子，实行特异性杀伤肿瘤治疗方案。所以，推动特异性靶点抗肿瘤新药研发，不仅是癌症患者的殷切希望，也是我国独立知识产权抗癌新药研发、民族制药产业发展和国家经济进一步腾飞的迫切需要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以进行乳腺肿瘤治疗和抑制的重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂。真核细胞内DNA合成蛋白因子Cdc6对细胞S期起始DNA复制至关重要。抑制细胞内Cdc6的表达，导致特异性S期肿瘤细胞死亡，而正常细胞仅发生周期阻滞。间歇性抑制细胞内Wc6基因表达,最终导致所有肿瘤细胞死亡,相反不影响正常细胞的生长。因此，DNA合成蛋白因子Cdc6可以作为特异性抗肿瘤治疗的靶标。腺相关病毒(AAV)具有自然缺陷、无包被和无致病原性，它能整合其基因组到19号染色体的一个特别位点并保持整合状态。AAV的位点特异性的整合能力、其自然缺陷以及其无致病原性使其成为基因治疗载体成为可能。在基因复制条件下AAV能复制产生子代病毒颗粒。因此我们将特异靶向Cdc6基因的小分子干扰RNA(SiRNA)插入AAV的特异位点，利用其复制特性，使AAV感染的细胞持续产生Cdc6siRNA。在此基础上，本专利技术提供一种重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂，其含有重组腺相关病毒AAV-shCdc6 ;所述重组腺相关病毒AAV-shCdc6是将特异性人Cdc6RNAi靶向序列的小分子干扰RNA(siRNA)插入AAV的特异位点后得到的。所述特异性人Cdc6RNAi靶向序列如SEQ ID N0.1所示。所述制剂中重组腺相关病毒AAV-shCdc6可以经浓缩后得到任意滴度的病毒液。优选病毒滴度为每毫升5X 1013。本专利技术的重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂的制备方法，包括以下步骤:(I)确定人Cdc6siRNA靶向序列第1091至1110碱基；(2)化学合成引物；(3)上述引物退火后，连接入腺病毒载体pAAV-GFP，得到pAAV-GFP_shCdc6 ；(4)应用 pAAV-GFP-shCdc6 和辅助载体质粒 pAAV_RC2 和 pHelper 共转染 293T 细胞；(5)细胞培养2天后，收集细胞培养上清，以1:100比例稀释再次感染293T细胞；(6)细胞培养2天后，收集细胞培养上清，离心收集病毒浓缩液。所述步骤(1)中的人Cdc6siRNA靶向序列第1091至1110碱基如SEQ ID N0.1所示。所述步骤⑵中的引物优选为:引物1:5，-GATTC gagatcaggttctggacaaA-3，，如 SEQ ID N0.2 所不；引物2:5，-AGCTTttgtccagaacctgatctcG-3，，如 SEQ ID N0.3 所不。本专利技术的重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂可以高效感染乳腺癌细胞，并持续表达特异靶向Cdc6的siRNA，最终能够特异性杀伤乳腺癌细胞，相反对正常乳腺上皮细胞没有杀伤作用。因此，重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂可以作为治疗乳腺癌的新型生物制剂。利用重组腺相关病毒(AAV)作为载体感染乳腺癌细胞，以DNA合成蛋白因子Cdc6作为特异性抗肿瘤治疗的靶标，制备重组腺相关病毒AAV-ShCdce制剂进行乳腺肿瘤治疗，具有高效、高特异、低副作用等巨大优势。【附图说明】图1为HBL-100和MCF7细胞感染病毒三天后，收集并裂解细胞，进行WesternBlot检测，用兔抗cdc6抗体检测cdc6表达水平，tubulin作为内参；图2为HBL-100和MCF7细胞感染病毒三天后，收集并进行PI染色，利用流式细胞仪进行细胞周期分析，表中数据为不同时期细胞所占的百分数；图3为裸鼠体内肿瘤抑制实验注射AAV-shcdce病毒液后肿瘤体积生长和处死后肿瘤数量比较。【具体实施方式】为进一步说明本专利技术，结合以下实施例具体说明，实施例中的百分比均为重量百分比含量。以下实施例中的腺相关病毒载体pAAV-ZsGreenl_hU6 (pAAV-GFP)购于Yrbio公司。腺相关病毒载体PAAV-RC2和pHelper以及293T细胞购于Stratagene公司。乳腺癌细胞MCF7购于ATCC。乳腺上皮细胞HBL-100购于上海研谨生物科技有限公司。实施例1:重组腺相关病毒AAV_shCdc6的制备I)设计特异性人Cdc6RNAi祀向序列通过计算机软件预测,确定人Cdc6siRNA革巴向序列第 1091 至 1110 碱基(gagatcaggttctggacaa,如 SEQ ID N0.1 所示)；2)化学合成以下引物:引物1:5’ -GATTC gagatcaggttctggacaaA-3，，如 SEQ ID N0.2 所不；引物2:5，-AGCTTttgtccagaacctgatctcG-3，，如 SEQ ID N0.3 所不；3)上述引物在55°C退火后，连接入腺病毒载体pAAV-GFP，得到pAAV-GFP-shCdc6 ；4)应用 pAAV-GFP_shCdc6 和辅助载体质粒(pAAV_RC2 和 pHelper)共转染 293T 细胞；5)细胞培养2天后，收集细胞培养上清，以1:100比例稀释再次感染293T细胞；6)细胞培养2天后，收集细胞培养上清，离心收集病毒浓缩液。采用逐孔稀释滴度测定法检测病毒滴度。实施例2:重组腺相关病毒AAV-Shcdc6对乳腺癌细胞的感染I)体外培养乳腺癌细胞MCF7和正常二倍体乳腺上皮细胞HBL-100 ；2)以1:100比例稀释病毒液(病毒滴度每毫升5X IO11)加入上述细胞，培养3天； 3)收集细胞，裂解后进行蛋白电泳，转膜后应用特异性兔抗Cdc6抗体进行WesternBlot,明确Cdc6蛋白表达抑制,结果见图1。实施例3:重组腺相关病毒AAV-shCdc6对乳腺癌细胞的特异性杀伤作用I)以1:100比例稀本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组腺相关病毒AAV?shCdc6制剂，其特征在于：含有重组腺相关病毒AAV?shCdc6；所述重组腺相关病毒AAV?shCdc6是将特异性人Cdc6RNAi靶向序列的小分子干扰RNA(siRNA)插入AAV的特异位点后得到的。
【技术特征摘要】
1.重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂，其特征在于:含有重组腺相关病毒AAV-shCdc6；所述重组腺相关病毒AAV-shCdc6是将特异性人Cdc6RNAi靶向序列的小分子干扰RNA(siRNA)插入AAV的特异位点后得到的。2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂，其特征在于:所述特异性人Cdc6RNAi靶向序列如SEQ ID NO-1所示。3.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂，其特征在于:所述制剂中病毒滴度为每毫升5 X IO1304.权利要求1-3任一项所述的重组腺相关病毒AAV-shCdc6制剂的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)石角定人Cdc6siRNA革巴向序列第1091至1110碱基； (2)化学合成引物； (3)上述引物退火后，连接入腺病毒载体pAAV-GFP，得到pAAV-GFP-shCdc6； (4)应用pAAV-GFP-shCdc6和辅助载体质粒pAAV_RC2和pHelper共...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜伟，朱长军，董智雄，
申请(专利权)人：天津亿海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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