本发明专利技术公开一种微电极阵列，该微电极阵列包含具由细胞尺寸大小的微洞构成的微电极。通过将单细胞直接定位在含有细胞大小的微洞的微电极上，细胞膜中活化胆固醇与溶液中胆固醇氧化酶反应，在电极表面产生过氧化氢，引发可测量的鲁米诺电致发光，该发光强度与细胞膜中的活化胆固醇量相关。通过连接多通道转换器和电压发生器，在阵列中的微电极会被依次施加一个脉冲三角波电压，当在微电极表面加电压的时候，这个细胞或者微电极才能发光，利用光电倍增管PMT检测鲁米诺的化学发光强度，获取细胞膜中活化胆固醇的含量。在本微电极阵列中，单细胞被电压选择进行检测，有利于测量的自动化和分析通量。本发明专利技术可实现快速检测细胞膜中活化胆固醇的含量。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种微电极阵列，该微电极阵列包含具由细胞尺寸大小的微洞构成的微电极。通过将单细胞直接定位在含有细胞大小的微洞的微电极上，细胞膜中活化胆固醇与溶液中胆固醇氧化酶反应，在电极表面产生过氧化氢，引发可测量的鲁米诺电致发光，该发光强度与细胞膜中的活化胆固醇量相关。通过连接多通道转换器和电压发生器，在阵列中的微电极会被依次施加一个脉冲三角波电压，当在微电极表面加电压的时候，这个细胞或者微电极才能发光，利用光电倍增管PMT检测鲁米诺的化学发光强度，获取细胞膜中活化胆固醇的含量。在本微电极阵列中，单细胞被电压选择进行检测，有利于测量的自动化和分析通量。本专利技术可实现快速检测细胞膜中活化胆固醇的含量。【专利说明】—种微电极阵列及其在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用
本专利技术涉及医药
，具体地涉及一种微电极阵列及其在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用。
技术介绍
细胞内部胆固醇的平衡对细胞功能有重要影响。尽管胆固醇主要分布于细胞膜，但也在脂筏或质膜微囊等神经鞘脂丰富的区域集中。这些区域的胆固醇比磷脂双分子层的胆固醇络合能力强，导致更高的化学活性(脱离倾向)，因此它们通常被称为活化胆固醇。近期研究表明细胞膜活化胆固醇可诱导细胞胆固醇的运输，包括抑制胆固醇合成，降低胆固醇摄入量和增强胆固醇外排。因此，对细胞膜活化胆固醇全面的研究，尤其是在单细胞水平的研究，对研究细胞内胆固醇运输有极大意义。环糊精和胆固醇氧化酶试剂已被用来分析细胞膜活化胆固醇。细胞膜活化胆固醇形成时，胆固醇与环糊精反应的速率和程度大大增加，能够有效的将细胞膜上的活化胆固醇溶解。因此可利用放射标记技术或色谱-质谱联用技术测定环糊精溶液中胆固醇的含量，获取细胞膜中活化胆固醇的信息。这种手段需要大量细胞，很难应用于单细胞胆固醇检测，不能研究细胞个体差异性。胆固醇氧化酶是一种催化胆固醇反应生成胆留烯酮和过氧化氢的酶，生成的过氧化氢可用amp lex red或quinoneimine试剂盒方法检测。研究发现,胆固醇氧化酶和细胞接触后，仅仅与细胞膜中活化胆固醇反应，所以可用于研究细胞膜活化胆固醇和磷脂细胞膜模型。但是这种方法还是很难被用于单细胞检测。原因在于:虽然amplex red试剂盒方法检测过氧化氢的灵敏度可达50nM，但所需过氧化氢的总量却为皮摩尔级，这就需要最少几千个细胞，无法达到单细胞检测的能力。通过精密地安置光路可提高检测灵敏度来减少细胞量，但却要极为复杂的仪器装置，降低了仪器使用的通用性。近期，修饰胆固醇氧化酶的微电极被用来检测单细胞细胞膜胆固醇。在这种方法中，微电极与单细胞的细胞膜接触，氧化细胞膜表面胆固醇，产生的过氧化氢被电极表面电压氧化产生电流，从而测得细胞膜胆固醇。此法可研究不同病变状态的单细胞，但是，该检测方法通量低，且需特殊的电化学装置，阻碍了其在生化领域的应用。所以，开发一种简单、经济的装置来检测单细胞细胞膜活化胆固醇是十分必要的。
技术实现思路
专利技术目的:为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出一种微电极阵列及其在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用，可以实现对单细胞表面活化胆固醇的快速检测。
技术实现思路
:为实现上述技术目的，本专利技术提出一种微电极阵列，该微电极阵列按照如下步骤制备:(1)将铟锡氧化物玻璃用腐蚀液腐蚀成8-36块，用甩胶机在铟锡氧化物玻璃上均匀涂一层的SU-8光刻胶；(2)将上述铟锡氧化物玻璃在电热板上先65°C _75°C软烤l_30min，再95°C -105°C软烤 l-90min ；(3)通过氧化铁掩模片利用光刻系统对铟锡氧化物玻璃上的光刻胶进行紫外照射35s-55s，然后在电热板上先 65°C _75°C软烤 l_3min，再 95°C _105°C软烤 l_4min ；(4)将步骤(3)中得到的铟锡氧化物玻璃移入SU-8显影剂溶液中清洗l_20min，从而在铟锡氧化物玻璃分成的8-36块上均产生一个微洞和一个连接导线的开口 ；所述氧化铁掩膜片上涂覆有遮挡紫外线的材料，被遮挡紫外线材料遮挡的部分即为微洞和连接导线开口的部分，而掩膜片其他部分则没有遮挡紫外线的材料，因此，当紫外线照射时，含有遮挡紫外线的材料的部分没有曝光，该部分可以被SU8显影液洗去，ΙΤ0玻璃就会暴露出来导电，而不含遮挡紫外线的材料的部分则曝光，该部分SU-8光刻胶就会固化，不会被洗去。(5)将上述含有微洞的铟锡氧化物玻璃在100°C -200°C硬烤20_60min ；(6)最后在铟锡氧化物玻璃上粘贴一个0型橡胶圈，形成一个细胞室，得到8-36微电极，即为一个微电极阵列；各个微电极通过上述连接导线的开口连接到多通道转换器上，然后再连接到电化学工作站上进行单细胞序列分析，0型圈内部盛放的细胞溶液为电解池溶液。其中，步骤(1)中SU-8光刻胶的厚度为20 μ m-100 μ m，优选地为30 μ m。步骤(1)中所述的腐蚀液为浓盐酸、浓硝酸和水的混合溶液，体积比为4:1:2其中，步骤(4)中所述的微洞的直径为20 μ m-100 μ m，优选地为30 μ m。本专利技术还提出了上述微电极阵列在检测单细胞表面活化胆固醇上的应用。利用所述微电极阵列检测单细胞表面活化胆固醇的步骤包括:(1)将细胞接种于培养基中，37°C下在含5%(v/v)的C02培养箱中培养12h，然后用胰蛋白酶从壁上消化下来；(2)将含有细胞的培养基滴在微电极阵列上，使细胞分别导入到微洞中，然后将在SU-8层表面的细胞冲掉；(3)将微洞中的细胞培养l_3h使其贴壁，用pH7.4的含有310mM蔗糖的0.5mM的磷酸盐缓冲溶液在37°C下在培养箱中培养0.5h-2.0h，使细胞活化；(4)以培养有细胞的微电极阵列作为工作电极，通过电化学工作站和多通道转换器在微电极上加一个脉冲三角波电压，并以Ag/AgCl电极和一根Pt导线分别作为参比和对电极连接，在该电化学系统中，通道转换的最短时间为2s。其中用于发光检测的微电极阵列上的溶液为PH7.4的含有L012的磷酸盐缓冲液，优选地，为含有200 μ M L012的500 μ LPBS(100mM pH7.4)。在微电极阵列上加一个0.5-1.0V，扫描速度为1V/S的周期性电压来收集背景发光信号，然后向微电极阵列中加入lU/mL的胆固醇氧化酶，通过光电倍增管(PMT)检测发光。将胆固醇氧化酶加入前后在1.0V时的发光比作为发光率；L012是一种高度灵敏的化学发光物质，比鲁米诺具有更高的发光效率，当电压高于0.5V的时候可诱导L012和过氧化氢的发光。为减少分析时间以获得更高的分析量，我们选择扫描速度为1.0V/S，0.5-1.0V的周期性电压分析单细胞；(5)用C0MS0L3.5软件进行有限元模拟，模拟加入胆固醇氧化酶之后微洞中过氧化氢的分布规律。其中，所述培养基为含10%(v/v)胎牛血清和1%(ν/ν)抗生素的DMEM高糖培养基，所述抗生素为青霉素和链霉素的混合物，其中青霉素浓度为100U/ml,链霉素浓度为lOOyg/mL.即培养基总体积是500ml，其中胎牛血清为50ml，青霉素和链霉素购入的为10000U/ml和10000 μ g/ml的混合溶液，加5ml入500ml中，相当于稀释100倍从而达到本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微电极阵列，其特征在于，该微电极阵列按照如下步骤制备得到：（1）将铟锡氧化物玻璃用腐蚀液腐蚀成8‑36块，用甩胶机在铟锡氧化物玻璃上均匀涂一层SU‑8光刻胶；（2）将上述铟锡氧化物玻璃在电热板上先65℃‑75℃软烤1‑30min，再95℃‑105℃软烤1‑90min；（3）通过氧化铁掩模片利用光刻系统对铟锡氧化物玻璃上的光刻胶进行紫外照射35s‑55s，然后在电热板上先65℃‑75℃软烤1‑3min，再95℃‑105℃软烤1min‑4min；（4）将步骤（3）中得到的铟锡氧化物玻璃移入SU‑8显影剂溶液中清洗1‑20min，从而在铟锡氧化物玻璃分成的8‑36块上均产生一个微洞和一个连接导线的开口；（5）将上述含有微洞的铟锡氧化物玻璃在100℃‑200℃硬烤20‑60min；（6）最后在铟锡氧化物玻璃上粘贴一个O型橡胶圈，形成一个细胞室，得到8‑36微电极，即为一个微电极阵列，各个微电极通过上述连接导线的开口连接到多通道转换器上，然后再连接到电化学工作站上进行单细胞序列分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方丹君，江德臣，田春秀，马光中，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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