本发明专利技术公开了一种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质及获取方法，填补了缺少芸薹属三基因组异源六倍体蔬菜种质的空白；本发明专利技术利用芸薹属蔬菜种质榨菜和紫甘蓝进行杂交，授粉后7天摘取子房，利用胚拯救获得成熟的种子，种子萌发后经过继代、扩繁获得大量的有性后代，经过杂种确定后，利用添加秋水仙素的液体培养基对单倍体进行加倍处理获得多基因组异源六倍体蔬菜种质。本发明专利技术可操作性强，简单实用，节省获得多基因组多倍体材料的时间，可以广泛应用于十字花科芸薹属蔬菜类种质的种间杂交的胚抢救，对于特殊植物新品种的培育和育种具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，涉及
为人工合成多基因组多倍体新种质的方法。
技术介绍
多倍体在植物中普遍存在，在植物的多样化过程中起着重要的作用。多倍体常使植株带来一些形态和生理上的变化，具有巨大性、代谢物增多、产量增加以及抗逆性加强等特点。鉴于其优良的特点，多倍体的创制具有重要的生产利用价值。目前对于多倍体植株的获得大都是通过人工合成的方法。人工合成多倍体新种质及其结构和功能演化的深入研究，是各国科学家竞相探索并研发应用的热点领域，也是我国具有竞争优势的基础性研究方向。随着人们对农产品要求的日益提高，利用自然界中已有的丰富遗传资源，通过各种远缘杂交获得多基因组多倍体，以及对多基因组多倍体的远缘杂种进行进一步利用，是培养“绿色、超级”农作物新种质的重要手段。因此多基因组多倍体材料具有重要的基础和应用价值。我国对主要农作物多基因组多倍体超级新种质的创制技术及其育种应用有迫切的需求。其中十字花科芸薹属是重要农作物(油料作物的油菜、蔬菜类的白菜、甘蓝、芥菜等)，重要模式 植物(拟南芥、荠菜等)和重要野生资源(盐芥、高山南芥等)的宝库。多倍体和种间杂交对十字花科植物基因组进化、系统发育、物种合成与品种培育均具重要的影响和作用。其中芸薹属包含ABC全部三基因组六倍体AABBCC新复合种的获得，对于后续研究与未来技术发展具有重要的作用。但是种间的远缘杂交通常具有生殖障碍，进而很难获得多基因组多倍体材料，阻碍了人们对于种质创新、基因组进化以及系统发育的研究。因此创制一种多基因组多倍体的材料以及其采用的方法至关重要。前期对于芸薹属多基因组多倍体的材料合成多集中于油料作物，如埃塞俄比亚芥菜与白菜型油菜杂交、芥菜型油菜与羽衣甘蓝杂交；同时也有关于油用芥菜与花椰菜杂交的报道，其虽然能够在自然条件下获得成熟的种子，但是获得真杂种的几率非常的低。在芥菜与花椰菜杂交的实验中，获得了 793粒种子，但是其中只有四粒种子为真杂种，杂种率仅有0.5%。目前除了直接利用两种材料直接进行杂交之外，还有研究报道通过多个种间材料多年进行多次杂交获得三基因组多倍体材料，但是这种方法加大了育种时间、人力物力的消耗。然而目前，对于芸薹属食用蔬菜类种质的三基因组多倍体创制及研究还是空白，从而阻碍了人们对于多基因组多倍体蔬菜新种质的研究及生产实际应用。本专利技术中采用芸薹属中的蔬菜类种质榨菜(基因组=AABB)和紫甘蓝(基因组:CC)作为研究材料，榨菜作为我国的特有蔬菜，富含功能性成分芥子硫苷，具有膨大的瘤状茎，具有重要的食用价值；而紫甘蓝所具有的紫色性状在抗虫害、保健功能等方面具有优势，因此通过这两种材料合成多基因组多倍体蔬菜新种质在抗性、保健功能及食用价值上具有重要的意义。研究发现榨菜和甘蓝的自然杂交不能获得后代，对于榨菜与紫甘蓝种间杂交获得多基因组多倍体蔬菜新种质还未见报道，并且还没有一种方法能够快速、有效地合成芸薹属多基因组多倍体蔬菜新种质。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是:—种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质，包含两杂交亲本榨菜和紫甘蓝全部的基因组DNA，其染色体DNA相对含量等于榨菜与紫甘蓝DNA相对含量之和，并同时具有榨菜和紫甘蓝的多态性扩增产物；并且其形态学与两杂交亲本相比较，表现出特有的植物学特征，表现为茎色为淡紫色、茎的着生方式为短缩茎，叶片呈卵圆形、较厚，表面无刺毛、无蜡质层，叶缘呈波状。上述榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质的获取方法，包括如下步骤:(1)芸薹属榨菜作为母本，芸薹属紫甘蓝作为父本进行有性杂交，授粉7天后摘取子房；所述授粉为连续两天重复授粉两次；(2)将子房消毒并冲洗；(3)将子房置于铺有用浓度为0.03g/mL的蔗糖溶液充分浸泡过的滤纸的培养皿上，剖开子房一端后沿腹缝线撕开，将胚珠连同胚柄及与胚柄相连的子房壁组织一同切下并接种到发 育培养基上；于25±2°C黑暗条件下培养24h，再光照条件下培养40天，光照强度为40μmο1.m-2 光照时间为12小时/天；所述发育培养基由MS(Murashige&Skoog)、蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭和水组成，蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.0004g/mL、0.002g/mL,余量为水，pH 为 5.8(4)将成熟种子摘下接种于发芽培养基上于25±2°C黑暗条件下培养；所述发芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-苄氨基嘌呤(6-BA)和水组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基嘌呤的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，余量为水，pH为5.8 ;(5)在种子萌发后30天将幼苗先转移到继代培养基、扩繁培养基上继代扩繁，培养条件为温度为25±2°C、光照强度为SOymol.m-2 ^1、光照时间为12小时/天；所述继代培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂和水组成，蔗糖、琼脂的质量含量分别为0.03g/mL、0.008g/mL,余量为水，pH为5.8 ;继代所采用的外植体为带2枚真叶的单芽茎段；所述扩繁培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA和水组成，蔗糖、琼脂、6-BA的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，余量为水，pH为5.8 ;扩繁所采用的外植体为附带腋芽的茎段；(6)组培幼苗具有4片真叶时，对其幼嫩叶片进行RAPD (随机扩增的多态性DNA)多态性分析及流式细胞鉴定，获得榨菜与紫甘蓝种间真杂种；(7)对鉴定为真杂种的幼苗进行加倍处理，加倍方法是利用添加秋水仙素的加倍液体培养基对单倍体茎段进行振荡培养，28°C，150rpm振荡培养两天；所述的加倍液体培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-ΒΑ、α-萘乙酸(NAA)和水组成，蔗糖、琼脂、6-ΒΑ、α-萘乙酸的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、2mg/L、0.lmg/L，余量为水，pH为5.8 ;秋水仙素终浓度为100mg/L ；(8)处理完毕后的外植体用无菌水冲洗干净后转移到不含秋水仙素的诱导芽培养基上培养诱导腋芽的产生，腋芽生长20天后切下转移到1/2MS培养基上生长，幼苗具有4片真叶时利用流式细胞术进行倍性的鉴定；所述诱导芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-BA和水组成，蔗糖、琼脂、6-BA的质量浓度分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.2mg/L，余量为水，pH 为 5.8(9)将加倍成功的幼苗移到生根培养基上进行生根培养，将生根后的幼苗取出，移栽至装有基质的营养钵中炼苗，炼苗时，先在幼苗上覆盖薄膜并遮荫，在炼苗3天后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境；最终获得芸薹属三基因组异源六倍体蔬菜新种质；所述生根培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、NAA和水组成，蔗糖、琼脂、NAA的质量体积比分别为0.03g/mL、0.008g/mL、0.lmg/L，余量为水，pH 为 5.8。本专利技术的有益效果是:本专利技术采用食用蔬菜种质榨菜与紫甘蓝作为杂交亲本材料，利用人工培养基对杂交胚珠进行培养使胚珠成熟为种子，种子萌发后再经过继代、扩繁及加倍，可在短期内获得大量的三基因组异源多倍体蔬菜新种质。该方法可操作性强，简单实用，节省本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质，其特征在于，三基因组异源六倍体蔬菜种质包含两杂交亲本榨菜和紫甘蓝全部的基因组DNA，其染色体DNA相对含量等于榨菜与紫甘蓝DNA相对含量之和，并同时具有榨菜和紫甘蓝的多态性扩增产物；并且其形态学与两杂交亲本相比较，表现出特有的植物学特征，表现为茎色为淡紫色、茎的着生方式为短缩茎，叶片呈卵圆形、较厚，表面无刺毛、无蜡质层，叶缘呈波状。
【技术特征摘要】
1.一种榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质，其特征在于，三基因组异源六倍体蔬菜种质包含两杂交亲本榨菜和紫甘蓝全部的基因组DNA，其染色体DNA相对含量等于榨菜与紫甘蓝DNA相对含量之和，并同时具有榨菜和紫甘蓝的多态性扩增产物；并且其形态学与两杂交亲本相比较，表现出特有的植物学特征，表现为茎色为淡紫色、茎的着生方式为短缩茎，叶片呈卵圆形、较厚，表面无刺毛、无蜡质层，叶缘呈波状。2.—种上述榨菜与紫甘蓝三基因组异源六倍体蔬菜种质的获取方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)芸薹属榨菜作为母本，芸薹属紫甘蓝作为父本进行有性杂交，授粉7天后摘取子房；所述授粉为连续两天重复授粉两次； (2)将子房消毒并冲洗； (3)将子房置于铺有用浓度为0.03 g/mL的蔗糖溶液充分浸泡过的滤纸的培养皿上，剖开子房一端后沿腹缝线撕开，将胚珠连同胚柄及与胚柄相连的子房壁组织一同切下并接种到发育培养基上；于25±2° C黑暗条件下培养24h，再光照条件下培养40天，光照强度为.40 μ mo I.π2 光照时间为12小时/天；所述发育培养基由MS (Murashige & Skoog)、蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭和水组成，蔗糖、琼脂、谷氨酰胺、活性炭的质量浓度分别为.0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.0004 g/mL、0.002g/mL,余量为水，pH 为 5.8 (4)将成熟种子摘下接种于发芽培养基上于25±2°C黑暗条件下培养；所述发芽培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂、6-苄氨基嘌呤(6-ΒΑ)和水组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基嘌呤的质量浓度分别为 0.03 g/mL、0.008 g/mL、0.2 mg/L，余量为水，pH 为 5.8 ; (5)在种子萌发后30天将幼苗先转移到继代培养基、扩繁培养基上继代扩繁，培养条件为温度为25 土 2。C、光照强度为80 1111101*111_2*8_1、光照时间为12小时/天；所述继代培养基由1/2MS、蔗糖、琼脂和水...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈利萍，李俊星，饶琳莉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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