一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法技术

本发明专利技术提供一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法：提取采后菠萝衰老过程各阶段的RNA；对菠萝成熟衰老过程中的转录组进行了测序，组装得到了81129个unique基因；在此基础上使用SSR软件MicroSAtellite(MISA)进行了SSR扫描，找到了35099个SSR分子标记，供菠萝多态性分析；对所有SSR重复单元在Unigene上前后序列的长度进行筛选。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物；不同物种间，进行PCR扩增并通过PAGE技术进行多态性检测。通过本发明专利技术，获得了菠萝衰老相关的基因表达谱，然后对获得的序列进行SSR标记扫描，确认其多态性。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术涉及
。
技术介绍
:菠萝是重要的热带水果，备受大家关注，但是菠萝基因组序列尚不清楚，现有分子标记不能满足研究需要，这给菠萝基因定位和多态性分析带来了不便。对菠萝进行多态性分析的分子标记方法很多，如SSR、SNP、RFLP等。大多数是借用其它物种现有的分子标记，或对有限的DNA序列进行扫描，查找获得。但是获得的这些标记，针对性不强，没有特异对某一生物途径相关的基因进行标记。
技术实现思路
:本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供，通过对菠萝果实衰老过程的RNA进行测序，查找与该事件相关基因的SSR标记。为了解决
技术介绍
所存在的问题，本专利技术采用以下技术方案:，包括以下步骤:(I)提取采后菠萝衰老过程各阶段的RNA ；(2)通过Illumina Solexa Hiseq2000对菠萝成熟衰老过程中的转录组进行了测序，组装得到了 81129个unique基因；(3)在此基础上使用SSR软件MicroSAtell ite (MISA)进行了 SSR扫描，找到了35099个SSR分子标记，供菠萝多态性分析；(4)对所有SSR重复单元在Unigene上前后序列的长度进行筛选。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物；(5)不同物种间，进行PCR扩增并通过PAGE技术进行多态性检测。进一步地，所述的步骤(1)中，在此过程植物组织样品不能解冻，提取的RNA质量要求是28S / 18S约2倍。进一步地，所述的步骤(2)中，RNA测序数据量要大于5G以上，质控标准要大于Q20以上。进一步地，所述的步骤(3)中，分别对1-6个核苷酸组成的重复序列进行筛选。进一步地，所述的步骤(4)中，引物筛选条件如下:引物不能存在SSR;将获得的引物与Unigene序列比对，引物的5'端允许有1_3个碱基的错配，3'端允许有I个碱基的错配，末端碱基除外；去掉与Unigene序列不匹配的引物，选择唯一匹配的引物；使用SSR_finder校验SSR，使用产物序列来寻找SSR，检验结果是否与MISA结果相同，并筛选出相同的SSR产物。进一步地，所述的步骤(5)中，优化扩增体系，控制PCR扩增饱和度，避免非特异扩增；PAGE电泳上样量3-5 μ L0与现有技术相比，本专利技术的有益效果是:本专利技术针对采后菠萝果实衰老过程的几个阶段，收集提取样品RNA进行测序，获得了菠萝衰老相关的基因表达谱，然后对获得的序列进行SSR标记扫描，确认其多态性。因为这些标记都是同衰老相关基因相连，可以对菠萝不同品种之间的衰老相关性状进行多态性分析。【附图说明】:图1是本专利技术方法流程图。图2是本专利技术原理解释图。【具体实施方式】:下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术作进一步描述:图1是本专利技术方法流程图。，包括以下步骤:(1)提取采后菠萝衰老过程各阶段的RNA ；(2)通过Illumina Solexa Hiseq2000对菠萝成熟衰老过程中的转录组进行了测序，组装得到了 81129个unique基因；(3)在此基础上使用SSR软件MicroSAtellite (MISA)进行了 SSR扫描，找到了35099个SSR分子标记，供菠萝多态性分析；(4)对所有SSR重复单元在Unigene上前后序列的长度进行筛选。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物；(5)不同物种间，进行PCR扩增并通过PAGE技术进行多态性检测。进一步地，所述的步骤(1)中，在此过程植物组织样品不能解冻，提取的RNA质量要求是28S / 18S约2倍。进一步地，所述的步骤(2)中，RNA测序数据量要大于5G以上，质控标准要大于Q20以上。进一步地，所述的步骤(3)中，分别对1-6个核苷酸组成的重复序列进行筛选。进一步地，所述的步骤(4)中，引物筛选条件如下:引物不能存在SSR;将获得的引物与Unigene序列比对，引物的5'端允许有1_3个碱基的错配，3'端允许有I个碱基的错配，末端碱基除外；去掉与Unigene序列不匹配的引物，选择唯一匹配的引物；使用SSR_finder校验SSR，使用产物序列来寻找SSR，检验结果是否与MISA结果相同，并筛选出相同的SSR产物。进一步地，所述的步骤(5)中，优化扩增体系，控制PCR扩增饱和度，避免非特异扩增；PAGE电泳上样量3-5 μ L.图2是本专利技术原理解释图。本专利技术的原理是:简单重复序列(Simple SequenceRepeat, SSR)又称微卫星DNA，指的是基因组中由1_6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下，其两端的序列高度保守，可设计引物进行PCR扩增，揭示其多态性。菠萝基因组序列尚不明确，通过Illumina Solexa Hiseq2000对菠萝成熟衰老过程中的转录本进行了测序，组装得到了 81129个unique基因，在此基础上使用SSR软件MicroSAtellite(MISA)进行了 SSR扫描，找到了 35099个SSR分子标记，供菠萝多态性分析。对所有SSR重复单元在Unigene上前后序列的长度进行筛选。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物。由于该分子标记分布在成熟衰老相关的基因中间，与菠萝衰老基因紧密连锁，其多态性标记有利于指导衰老相关性状的基因定位和杂交育种。也可以通过该方法开发其它的分子标记，如SNP、RFLP等，用于衰老相关基因的基因定位或多态性分析。最后应当说明的是，以上实施例仅用说明本专利技术的技术方案，而非对本专利技术保护范围的限制，尽管参照具体实施例对本专利技术作了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的实质和范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法，其特征在于，它包括如下步骤：(1)提取采后菠萝衰老过程各阶段的RNA；(2)通过Illumina?Solexa?Hiseq2000对菠萝成熟衰老过程中的转录组进行了测序，组装得到了81129个unique基因；(3)在此基础上使用SSR软件MicroSAtellite(MISA)进行了SSR扫描，找到了35099个SSR分子标记，供菠萝多态性分析；(4)对所有SSR重复单元在Unigene上前后序列的长度进行筛选。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物；(5)不同物种间，进行PCR扩增并通过PAGE技术进行多态性检测。

【技术特征摘要】
1.一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法，其特征在于，它包括如下步骤: (1)提取采后菠萝衰老过程各阶段的RNA； (2)通过IlluminaSolexa Hiseq2000对菠萝成熟衰老过程中的转录组进行了测序,组装得到了 81129个unique基因； (3)在此基础上使用SSR软件MicroSAtellite(MISA)进行了 SSR扫描，找到了 35099个SSR分子标记,供菠萝多态性分析； (4)对所有SSR重复单元在Unigene上前后序列的长度进行筛选。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其设计引物； (5)不同物种间，进行PCR扩增并通过PAGE技术进行多态性检测。2.根据权利要求1所述的一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法，所述的步骤(I)中，在此过程植物组织样品不能解冻，提取的RNA质量要求是28S / 18S约2倍。3.根据权利要求1所述的一种菠萝成熟衰老相关基因的分子标记方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鲁斌，常金梅，贾志伟，谷会，弓德强，洪克前，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：