摩氏摩根菌快速检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种摩氏摩根菌快速检测试剂盒及应用，所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C和冻存管D，所述冻存管A内装有用于PCR反应的Taq?DNA聚合酶、10×buffer、dNTP?mixture和引物的混合制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C装有阳性对照液，冻存管D装有稀释液；本发明专利技术试剂盒仅一步PCR便可准确、快速地鉴定摩氏摩根菌；与传统分离鉴定方法相比，该方法操作简便，省时省力，特异性与灵敏性好，灵敏性可达102CFU/mL，结果准确可靠并简单易读，适用于大通量的检测操作。

【技术实现步骤摘要】
摩氏摩根菌快速检测试剂盒及应用(-)
本专利技术涉及人兽鱼共患病原菌的鉴别诊断，基于PCR方法，建立摩氏摩根菌的快速检测技术，即摩氏摩根菌快速检测试剂盒及检测方法。(二)
技术介绍
摩氏摩根菌(Morganella morganii)属于肠杆菌科摩根菌属，广泛分布于土壤、污水、人和动物的肠道等。摩氏摩根菌为条件致病菌，主要感染呼吸道、尿道及伤口，引起人的脓毒症、肺炎、中枢神经症状、心包炎、绒毛膜羊膜炎、腹膜炎等，甚至引起人的大范围溶血而导致急性死亡，是重要的医院继发性感染致病菌。摩氏摩根菌还可感染多种养殖动物，如海狸鼠、袋鼠、猪、鸡以及锦鲤、蛇、鳖、龟、鼋等水生动物，引起皮肤溃烂、肌肉出血、肺淤血、肺脓肿、肾出血、炎症等病变，并具有致死性。随着摩氏摩根菌感染的不断上升趋势，给人类健康、养殖业发展与公共卫生均造成了巨大的威胁，摩氏摩根菌已成为一种重要的人兽鱼共患病原菌，日益受到各有关方面的关注。因此。亟需建立可准确、快速鉴定该菌的方法。目前，国内外对摩氏摩根菌的检测技术研究较少，仍主要依赖于传统分离鉴定方法(如生化反应等)，不仅操作繁琐、费时、费力，而且存在灵敏度不高和试验结果差异大等弊端。PCR技术因其具有特异与灵敏的特点，在病原检测领域具有越来越重要的地位。基于PCR反应的摩氏摩根菌鉴定方法虽有少量探索，但离实际应用于大批量样本的日常检测仍有较大距离，迄今尚无可用的快速检测方法。本专利技术将通过对引物的选择、检测条件的优化，设计一种准确、灵敏、简便、快速的多重PCR检测试剂盒，以期填补上述的空白。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种准确、灵敏、简便、快速的摩氏摩根菌检测试剂盒及方法。本专利技术采用的技术方案是:本专利技术提供一种摩氏摩根菌快速检测试剂盒，所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C和冻存管D，所述冻存管A内装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10Xbuffer、dNTP mixture和引物的混合液制备的冻干粉,冻存管B装有裂解液，冻存管C装有阳性对照液，冻存管D装有稀释液，所述稀释液为高压灭菌双蒸水；所述引物序列为:Ml-F:CTCGCACCATCAGATGAACCCATAMl-R:CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG。进一步，所述冻存管A内冻干粉是将混合液先在_80°C超低温冰箱预冻10h，再放入冻干机(干燥箱压力0.03MPa)，温度设为-40°C (升华干燥阶段)持续冻干30h，除去90%以上水分；之后温度升至25°C进行解析干燥2h (升温速率为1.5°C /min)，使水分含量达到5% (质量浓度)以下，获得冻干粉；所述每4.4 μ L混合液组成为:Taq DNA聚合酶0.3 μ L，10 Xbuffer2.5 μ L, dNTP mixture0.6 μ L,浓度均为 50 μ M 的引物 M1_F、M1_R 各 0.5 μ L，所述 dNTP mixture 由终浓度均为 IOmM 的 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 构成。进一步，所述裂解液终浓度组成为:体积浓度4%Triton-X100，5mg/mL NaN3, ImoI/L Tris, pH 值 8.0,溶剂为蒸懼水,配制方法:Triton-X1004mL, NaN3 (终浓度 5mg/mL)500mg,Tris (终浓度lmol/L) 12.114g,用IOM氢氧化钠水溶液调pH至8.0,蒸懼水定容至lOOmL。进一步，所述阳性对照液为摩氏摩根菌阳性对照液(溶剂是双蒸水，pH是7)，所述阳性对照缓冲液为摩氏摩根菌参考株ATCC25830接种在BHI培养基中，37°C培养过夜后，取菌液100°C煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用双蒸水重悬，制成阳性对照液。进一步，所述PCR反应管根据待检样品量定，通常试剂盒内所述PCR反应管为100 ~300 个。进一步，优选所述试剂盒有100个PCR反应管(满足100次PCR反应的用量)，所述冻存管A内冻干粉的用量以冻干前混合液体积计为440 μ L，所述冻存管B内装有ImL裂解液，所述冻存管C内装有0.5mL阳性对照液，所述冻存管D内装有ImL稀释液(通常冻存管D内的稀释液是一次性加入冻存管A，供100次PCR反应用)各个冻存管内装样量根据PCR反应管个数定，每次PCR反应需要25 μ L反应液,即冻存管D内稀释液与冻存管A内冻干粉混悬制备的混悬液10 μ L、裂解液10 μ L、对照液或待检样品5 μ L，稀释液与冻干粉冻干前的混合液体积比为25:11。本专利技术还提供一种利用所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒检测摩式摩根菌的方法，所述方法按如下步骤进行:(I)将冻存管D中稀释液加至冻存管A中，重悬、混匀，获得混悬液，存放于_20°C备用(PCR反应前先在室温解冻);所述冻存管A内冻干粉用量以冻干前混合液体积计，所述冻存管D中稀释液与混合液体积比25:11 ;(2)将冻存管B中的裂解液分别加入PCR反应管，分为对照PCR反应管和待检PCR反应管，再将冻存管C中的阳性对照液加入对照PCR反应管，将待检样品加入待检PCR反应管，混合均匀，然后将步骤(1)冻存管A中的混悬液加入各个PCR反应管，立即进行PCR扩增；所述待检样品为待检菌株接种于BHI培养基，37°C振荡培养过夜，取菌液100°C煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用高压灭菌双蒸水重悬，制成待检样品；所述冻存管B中裂解液与冻存管A中混悬液体积比为1:1，所述冻存管B中裂解液与冻存管C中阳性对照液体积比为2:1，所述冻存管B中裂解液与待检样品体积比为2:1 ;所述BHI培养基按BHI培养基标准配法，即3.7gBHI粉溶于IOOmL蒸馏水，高压灭菌)；(3)将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增:95°C预热3min ;94°C变性lmin，62°C退火 45s，72。。延伸 50s, 30 个循环;72°C保持 5min ；(4)将扩增后的产物在质量浓度1%琼脂糖凝胶与0.5XTBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统读取数据并记录；(5)结果判定:检测后，待检样品与阳性对照液同时扩增出809bp条带的为摩氏摩根菌阳性；阳性对照液出现条带而待检样品无条带的为摩氏摩根菌阴性；待检样品与阳性对照液均无条带或待检样品出现条带而阳性对照液无条带的需重新检测并判定。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在:本专利技术提供一种摩氏摩根菌快速检测试剂盒，该试剂盒仅一步PCR便可准确、快速地鉴定摩氏摩根菌；与传统分离鉴定方法相比，该方法操作简便，省时省力，特异性与灵敏性好，灵敏性可达102CFU /mL，结果准确可靠并简单易读，适用于大通量的检测操作。(四)【附图说明】图1为凝胶电泳图，其中:A中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker,泳道I为摩氏摩根菌阳性对照品，泳道2为待检样品(阳性)。B中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker,泳道I为摩氏摩根菌阳性对照品，泳道2为待检样品(阴性)。C中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker,泳道I为摩氏摩根菌阳性对照品(未见条带)，泳道2为待检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C和冻存管D，所述冻存管A内装有用于PCR反应的Taq?DNA聚合酶、10×buffer、dNTP?mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C装有阳性对照液，冻存管D装有稀释液，所述稀释液为双蒸水；所述引物序列为：M1?F：CTCGCACCATCAGATGAACCCATAM1?R：CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG。

【技术特征摘要】
1.一种摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C和冻存管D，所述冻存管A内装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10Xbuffer、dNTP mixture和引物的混合液制备的冻干粉,冻存管B装有裂解液，冻存管C装有阳性对照液，冻存管D装有稀释液，所述稀释液为双蒸水；所述引物序列为:Ml-F:CTCGCACCATCAGATGAACCCATAMl-R:CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG。2.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述冻存管A内冻干粉是将混合液在_80°C预冻10h，再在-40°C冻干30h，然后以1.5°C /min的速率升温至25°C干燥2h使水分含量达到5%以下，获得冻干粉；所述每4.4 μ L混合液组成为:Taq DNA聚合酶 0.3 μ L，10 Xbuffer2.5 μ L, dNTP mixture0.6 μ L,浓度均为 50 μ M 的引物 M1_F、M1_R 各0.5 μ L，所述 dNTP mixture 由终浓度均为 IOmM 的 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 的构成。3.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述裂解液终浓度组成为:体积浓度 4%Triton_X100, 5mg/mL NaN3, lmol/L Tris, pH 值 8.0,溶剂为蒸懼水。4.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照液为摩氏摩根菌阳性对照液。5.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应管为100 ~300 个。6.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒有100个PCR反应管，所述冻存管A内冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈健舜，
申请(专利权)人：浙江省水产技术推广总站，
类型：发明
国别省市：