一种青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种生物工程技术领域的青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其改良植物对提高青蒿中青蒿素含量及对病虫害抗性上的应用。本发明专利技术所涉及的分离的DNA分子包括：编码具有青蒿MYC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ?ID?NO.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列有至少70%的同源性。本发明专利技术涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，还涉及被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明专利技术将所说的基因在植物中表达，获得的转基因青蒿植物中青蒿素的含量有了明显的提高，同时该转基因青蒿对灰霉菌的抗性有显著的增强。

【技术实现步骤摘要】
—种青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其应用
本专利技术涉及基因工程
。具体地，本专利技术涉及一种在青蒿中表达的MYC2转录因子蛋白编码的核苷酸序列。本专利技术还涉及编码该蛋白的核苷酸序列的用途。
技术介绍
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半職内酯化合物,是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同种植环境和种植品种中其平均含量在青蒿叶片干重的0.01-1%，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高。虽然目前有人成功利用酵母发酵产生青蒿素前体物质青蒿酸，还需将青蒿酸人工化学半合成至青蒿素，该研究尚处于实验室研发初级阶段。也有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1%，在芽中最高也只有干重的0.16%，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。经对现有技术文献检索发现，Bruno Dombrecht等在《The Plant Cell)),2007 年 19 卷 2225-2245 页发表了题为“MYC2Differentially Modulates DiverseJasmonate-Dependent Functions in Arabidopsis.” 的论文，报道了拟南芥中 MYC2 转录因子蛋白是拟南芥茉莉酸信号转导途径的核心转录因子。Hongbo Zhang等在《MolecularPlant》, 2012 年 5 卷 73-84 页发表了题为“Tobacco Transcription Factors NtMYC2a andNtMYC2b Form Nuclear Complexes with the NtJAZl Repressor and Regulate MultipleJasmonate-1nducible Steps in Nicotine Biosynthesis” 的论文,报道了 MYC2 转录因子在烟草中通过茉莉酸介导途径调控尼古丁的生物合成。在本专利技术被公布前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其应用。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种新的青蒿MYC2转录因子蛋白编码核苷酸序列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高青蒿素含量及显著提高对灰霉菌的抗性。本专利技术是通过以下技术方案实现的:本专利技术提供的技术方案之一是:提供一种DNA分子，其喊基序列中包含(a)或(b)的喊基序列:(a) SEQ ID N0.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID N0.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列有至少70%同源性的核苷酸序列；(b)在40-55°C条件下能与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该DNA分子能够编码具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列的多肽。优选地，所述的DNA分子序列具有SEQ ID N0.3中核苷酸第301-2175位的核苷酸序列。本专利技术提供的技术方案之二是:一种分离的蛋白质，其为具有如SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的多肽，或为具有如SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的多肽的保守性变异多肽或其活性片段，或其活性衍生物。其中，所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为:从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。上述蛋白质命名为青蒿MYC2转录因子。本专利技术提供的技术方案之三是:一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含前述的核酸分子。其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即:将本专利技术所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本专利技术所述载体优选地为质粒载体。载体中包含前述DNA分子的碱基序列。本专利技术提供的技术方案之四是:一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为:将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的编码MYC2转录因子蛋白基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为:大肠杆菌DH5ci，农杆菌EHA105。将前述重组表达质粒转化至大肠杆菌DH5 α，农杆菌ΕΗΑ105中，即可得本专利技术优选的基因工程菌株。本专利技术转化体中包含前述的载体。本专利技术提供的技术方案之五是:—种转化细胞,所述转化细胞是通过前述载体转化得到的真核细胞或原核细胞，含有前述DNA分子。本专利技术提供的技术方案之六是:一种转基因植物，所述转基因植物是通过前述转化得到的真核细胞培养得到的。本专利技术提供的技术方案之七是:前述DNA分子在提高植物中青蒿素含量中的应用。优选地，所述植物为青蒿。本专利技术提供的技术方案之八是:前述DNA分子在提高植物对灰霉菌抗性中的应用。优选地，所述植物为青蒿。本专利技术提供的技术方案之九是:—种提高青蒿中青蒿素含量的方法，技术方案包括:(I)将包含前述DNA分子可操作地连接于植物表达调控序列上，形成植物表达载体；( 2)将步骤(1)中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤(1)中所述的表达载体的农杆菌侵染转化青蒿植物细胞；(3)通过抗生素筛选，获得含有前述DNA分子的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。具体步骤如下:(I)将编码具有青蒿MYC2转录因子蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连接于植物表达调控序列上，形成含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID N0.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)将步骤(1)中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤(1)中所述的表达载体的农杆菌通过叶盘法侵染转化同真核宿主细胞共培养，在22-28°C条件下，暗培养1-2天;(3)通过抗生素筛选，获得含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代，含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的转基因青蒿植物及其后代中青蒿素含量有显著提高。较佳地，该方法中使用的核酸分子具有SEQ ID N0.3中第301-2175位的核苷酸序列。本专利技术提供的技术方`案之十是:一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA分子，其碱基序列中包含（a）或（b）的碱基序列：（a）SEQ?ID?NO.3中第301?2175位碱基所示的核苷酸序列，或者与SEQ?ID?NO.3中第301?2175位碱基所示的核苷酸序列有至少70%同源性的核苷酸序列；（b）在40?55℃条件下能与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，其碱基序列中包含(a)或(b)的碱基序列: (a)SEQ ID N0.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列，或者 与SEQ ID N0.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列有至少70%同源性的核苷酸序列； (b)在40-55°C条件下能与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。2.一种载体，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。3.一种转化体，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。4.一种转化细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。5.一种转基因植物，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。6.如权利要求1所述的DNA分子，在提高植物中青蒿素含量中的应用。7.如权利要求1所述的DNA分子，在提高植物对灰霉菌抗性中的应用。8...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，沈乾，陆续，付雪晴，颜廷祥，孙小芬，王国丰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：