TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用技术方案

本发明专利技术TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，属于生物技术领域。TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为：TERT启动子chr5,1,295,228位为C或T的碱基多态性序列；TERT启动子chr5,1,295,242-1,295,243位为CC或TT的碱基多态性序列；TERT启动子chr5,1,295,250位为C或T的碱基多态性序列。所述泌尿系统肿瘤为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌。本发明专利技术的优点在于首次在泌尿系肿瘤中发现TERT启动子的高频突变，为泌尿生殖系统肿瘤预后和监测的提供一种新的生物标志物。

【技术实现步骤摘要】
TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用。
技术介绍
膀胱癌是排在第九位的全球最常见的肿瘤。2013年，在美国有超过73000名患者被诊断为膀胱癌，其中死亡人数约15000人。其中超过90%的患者最初诊断为原发性膀胱癌，大约75%的患者目前为表浅膀胱肿瘤，20%的为浸润性膀胱肿瘤，剩下的5%初诊为转移性肿瘤。先前的研究表明，膀胱癌有着多变的临床表现和遗传背景。最近的膀胱肿瘤研究报道了 8 个相关基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300, NCORl，ARID1A, CHD6)。目前检测“膀胱癌”采用的肿瘤标记物主要有以下几种，但是各肿瘤标志物都存在不同的缺点: (1)、膀胱肿瘤抗原(BTA):BTA试剂分为BTA stat和BTA test两种；首先，这两种试剂都不能独立用于确诊膀胱癌；另外，BTA试剂价格昂贵，目前尚难以全面推广使用； (2)、LewisX抗原检测:Lewis X是ー种ABO血型相关抗原，在正常尿路上皮中不存在该抗原；而5%~89%的移行细胞癌可检出Lewis X,但Lewis X与肿瘤的分级无关； (3)、核基质蛋白22(nuclear matrix protein22,NMP22):NMP22是核有丝分裂器蛋白，诊断膀胱癌的敏感性为48%~90%，特异性为70%~92%，NMP22对高级，高期膀胱癌敏感性较高； (4)、纤维蛋白/纤维蛋白降解产物(fibrindegradation products, FDP):用快速免疫检测法測定尿中FDP诊断膀胱癌的敏感性为68%，对T2~T4期膀胱癌的敏感性更是高达100% ； (5)、玻璃酸酶检测hyaluronidase,HAase:玻璃酸酶是ー种细胞外降解基质透明质酸的内源性糖苷酶，在肿瘤进展中起重要作用，应用凝胶技术检测G2，G3级膀胱癌尿液中玻璃酸酶活性，敏感性达92%~100% ； (6)、端粒酶活性(telomerase):端粒是位于染色体末端的保护性结构，随细胞分裂逐步缩短，直至细胞死亡，端粒酶的作用就是延长端粒，现已发现多种肿瘤细胞中端粒酶活性增强，该法诊断包括低级，低期肿瘤在内的膀胱癌，敏感性可达91%。然而，导致膀胱肿瘤发生的关键点仍未完全阐明，同时由于这些个体标记的灵敏性较低以至于未被应用于临床实践中，这表明需要新的灵敏性高的生物标记。
技术实现思路
在本专利技术的试验过程中，在超过85%的人类肿瘤研究中发现端粒酶逆转录酶(TERT, TERT通过Human Genome Browser获取NCBI发布版本37的人类基因组序列:Feb.2009 (GRCh37/hgl9 ) ；>hgl9_ensGene_ENST00000310581_0 range=chr5:1295163-1296562 5’pad=400 3’pad=0 strand=- repeatMasking=none)活跃，我们认为是一个人类肿瘤发生的重要机制。TERT是端粒酶的催化部分，位于5号染色体短臂，在人类肿瘤中调节端粒酶活性。最近人们应用全基因组测序在黑素瘤中发现TERT启动子突变。人们在ー些膀胱癌样本中证实了高频率的TERT启动子突变。ー些研究发现，具有活性的端粒酶或TERT表达增加与肿瘤的病理分期以及临床分期是相关联的。然而，人们还未获得TERT基因拷贝，TERT的表达或活性对膀胱癌的临床影响仍然是有争议的。在本专利技术中，我们通过试验得到TERT启动子的高频突变位点，并进行了相关的体外功能分析试验来证实:这些启动子的突变可提高ETRT活性，是导致恶性肿瘤发生的关键点所在，还分析了应用临床病理因素来评估TERT基因作为早期癌症检测和预后的生物标记的作用，表明这些突变对泌尿生殖系统恶性肿瘤的诊断和预后具有重要的意义。本专利技术的目的在于公开了 TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的: TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为: TERT启动子chr5，I, 295，228位为C或T的碱基多态性序列； TERT启动子chr5，I, 295，242-1，295，243位为CC或TT的碱基多态性序列； TERT启动子chr5，I, 295，250位为C或T的碱基多态性序列。上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其中，所述泌尿系统肿·瘤为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌。上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其中，所述应用包括下述步骤: (1)、从样本泌尿系统组织中提取DNA； (2)、以包含TERT启动子基因的待测基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增TERT启动子基因，所述引物对P为:TF:5，-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3，，TR:5’ -GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’ ； PCR扩增完成后，对PCR产物进行sanger测序，当样本中含有TERT启动子的单核苷酸多态性序列时，该样本为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌样本。上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其中，所述的PCR反应体系体积为20 iil，含有dNTP 2 u IUO X PCR Buffer 2 U I,TF(10 PM) I U I, TR(10 U M) Iii 1、模板 DNA IuU dH20 12.5 ii I 和 TaKaRa Taq HS0.5 u I。上述技术方案所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其中，所述的PCR扩增反应程序为:93°C 2分钟预变性，然后按93°C I分钟，55°C I分钟，72°C I分钟，共40做个循环，最后72°C 7分钟延伸。本专利技术具有以下有益效果: 1、本专利技术为检测膀胱癌提供一种新的肿瘤标志物，对发现膀胱癌及其相关疾病的易感人群和基因诊断有重要价值；2、本专利技术中的TERT启动子的高频突变可能膀胱癌发生的关键点所在，对探索膀胱癌等疾病的发病机制有重要意义； 3、本专利技术为临床生物治疗提供了分子靶向，同时也开辟新的治疗途径起到重要作用。【附图说明】: 图1为通过ABI 3730 XL测序仪对PCR产物进行sanger测序得到的反链上体细胞突变位点； 图2为PCR(RT-PCR)对TERT表达的分析结果，其中WT为野生型、C228T为正链chr5，I, 295，228C>T 突变和 C250T 为正链 chr5, I, 295，250 OT ； 图3为蛋白免疫印记技术检测TERT的表达分析结果，其中WT为野生型、C228T为正链chr5, 1，295，228C>T 突变和 C250T 为正链 chr5, I, 295, 250 OT ； 图4为染色质免疫共沉淀(ChIP)试验检测TERT表达分析结果，其中WT为野生型、C22本文档来自技高网...

【技术保护点】
TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为：TERT启动子chr5,?1,295,228位为C或T的碱基多态性序列；TERT启动子chr5,?1,295,242?1,295,243位为CC或TT的碱基多态性序列；TERT启动子chr5,?1,295,250位为C或T的碱基多态性序列。

【技术特征摘要】
1.TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，所述TERT启动子的单核苷酸多态性序列为: TERT启动子chr5，I, 295，228位为C或T的碱基多态性序列； TERT启动子chr5，I, 295，242-1，295，243位为CC或TT的碱基多态性序列； TERT启动子chr5，I, 295，250位为C或T的碱基多态性序列。2.根据权利要求1所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其特征在于:所述泌尿系统肿瘤为膀胱移行细胞癌或上尿路上皮细胞癌。3.根据权利要求1或2所述的TERT启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用，其特征在于，所述应用包括下述步骤: (1)、从样本泌尿系统组织中提取DNA； (2)、以包含TERT启动子基因的待测基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增TERT启动子基因，所述引物对P为:TF:5，-CAGCGCTGCCTGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴松，黄毅，王波，蔡志明，梅红兵，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：